ESQUEMA GENERAL SESIÓN I: TRANSFORMAR cepas de E. coli con un plásmido para que adquieran resistencia a un antibiótico SESIÓN 2: AISLAR el plásmido mediante la técnica de Lisis alcalina SESIÓN 3: FUNCIóN DE LAS ENZIMAS DE RESTRICCIÓN Cortar el plásmido aislado con enzimas de restricción y visualizarlo en un gel de agarosa teñido con bromuro de etidio

OBJETIVO DE LA PRÁCTICA: OBTENER BACTERIAS RESISTENTES A KANAMICINA Escherichia coli Medio LB + KANAMICINA

Se “introducirá el vector pET-TEM Sitio múltiple de restricción Gen que confiere resistencia a kanamicina: kanamicina fosfotransferasa Origen de replicación

PURIFICACIÓN PLÁSMIDOS Niveles de impurezas aceptados por la FDA Ccc: supercoiled circular covalently closed Oc: open circular

La diferencia en TAMAÑO entre el DNA cromosomal y el DNA plasmídico permite desarrrollar estrategias de purificación Plásmidos

TOPOISÓMEROS DE PLÁSMIDOS: diferentes formas de enrollamiento

TOPOISÓMEROS DE PLÁSMIDOS: diferentes formas de enrollamiento

TOPOISÓMEROS DE PLÁSMIDOS: diferentes formas de enrollamiento

PURIFICACIÓN PLÁSMIDOS Niveles de impurezas aceptados por la FDA Ccc: supercoiled circular covalently closed Oc: open circular

Purificación de plásmidos Química Mecánica Cambios en la Tempratura 1. Lisis 2. Remover partículas grandes Centrifugación Filtración (uso de membranas) 3. Purificación intermedia Precipitación fraccionada Adsorción a membranas Métodos cromatográficos: Intercambio iónico Filtración en gel Afinidad 4. Purificación alta resolución Disolver Liofilizar Formular 5. Conservar

ESQUEMA GENERAL DEL AISLAMIENTO DE PLÁSMIDOS POR LA TÉCNICA DE LISIS ALCALINA

Aislamiento de plásmidos por el método de lisis alcalina Las bacterias se dejan crecer hasta una fase estacionaria

Solución GTE: Glucosa/Tris-HCl/EDTA pH=7.9 La glucosa no tiene carga pero es un osmolito El EDTA une cationes divalentes como Mg2+ y Ca2+ en la membrana celular, debilitando la membrana. También el Mg2+ es cofactor de Dnasas

Componentes de la solución GTE Glucosa Tris-HCl

Solución de lisis: NaOH 0.2 N / SDS 1% Esta solución disuelve los fosfolípidos y los componentes proteícos de las membranas celulares. SE ROMPE LA MEMBRANA DE LAS CÉLULAS El NaOH desnaturaliza el DNA plasmídico y cromosomal

Acetato de Potasio: Precipita el SDS junto con proteínas y lípidos. El DNA cromosomal que se renaturaliza se “atrapa” en el precipitado SDS/proteínas/lípidos. Sólo el DNA plasmídico y moléculas de RNA “escapan” del precipitado y SE ENCUENTRAN EN EL SOBRENADANTE

El isopropanol precipita los ácidos nucleícos Incubar por 20 min a -20°C El isopropanol precipita los ácidos nucleícos Lavar el “botón” con etanol al 70%: remueve sales y remanentes de SDS. También remueve el isopropanol. La mezcla isopropanol-etanol se evapora más rápido

Purificación de plásmidos Por ejemplo unión al pétido 16mer NH2-Cys-Met-Lys-Tyr-Val-Ser-His-Gly-Thr-Val-Ser-Arg-Val-Val-Asn-Gln-COOH

Electroforesis en geles de agarosa ¿Cómo podríamos monitorear el progreso de la purificación de plásmidos? Absorbancia 260 nm Electroforesis en geles de agarosa

Por la electroforesis en geles de agarosa se debe monitorear la purificación de plásmidos 1 Precipitación con isopropanol 2 Cromatografía intercambío aniónico 3 Filtración con membrana de nitrocelulosa 4 Lo que se retuvo en la membrana de nitrocelulosa DNA cromosomal Plásmido abierto Plásmido superenrrollado

Microscopia de polímero de agarosa

Uso de “colorantes”

Tinción con Syber Safe