Purificación de proteínas Parte II 20 Agosto, 2013

Purificación de proteínas Proceso que cuenta con varias etapas cuyo objetivo es lograr la concentración diferencial de una proteína o molécula de interés

Métodos de Baja resolución Métodos de Alta Resolución Empezar a separar Métodos de Baja resolución Precipitación con sales, solventes, temperatura o pH Métodos cromatográficos: filtración en gel, intercambio iónico, afinidad Métodos electroforéticos: electroforesis no desnaturalizante, desnaturalizante Métodos de Alta Resolución

Características Procedimiento Solubilidad Salting in Salting out Carga iónica Cromatografia de intercambio iónico Electroforesis Polaridad Cromatografía de adsorción Cromatografía en papel Cromatografía en fase reversa Cromatografía interacción hidrófoba Tamaño molecular Dialisis y ultrafiltración Electroforesis en gel Cromatografía de filtración en gel Ultracentrifugación Especificidad de unión 1. Cromatografía de afinidad

Propiedades Sal más usada: Sulfato de Amonio

Solubilidad de las proteínas en Sulfato de Amonio Fibrinogeno Mioglobina

Lactato deshidrogenasa 1.1.1.27

Precipitación por salado Homogenización 100 g de pechuga de pollo troceado (sin grasa ni tejido conectivo) Licuar en frío (3 Vol de Amortiguador por gramo de tejido, 3 pulsos/3 seg.) Filtrar mezcla en gasa. Tomar fracción cero (F0) Centrifugar a 7,000 rpm 4° C 10 min. Decantar sndnte y tomar fracción 1 mL (F1) Guardar fracciones a -20°C Precipitación por salado 25 mL del sndnte en vaso de pp. Agitar en hielo y añadir lentamente 8.15 g de sulfato de amonio (55 % de saturación) Centrifugar a 4°C a 10,000 rpm 10 min. Registrar volumen y tomar 1 mL fracción 2 (F2) Guardar a -20°C Realizar segunda precipitación para llegar a 75 %, repetir pasos 2 y 3 Descartar el sndante Resuspender botón o pellet en 1 mL de agua Distribuir en 3 tubos, uno de ellos con 1 mL. Guardar a -20°C

Carga pH solución> pI= proteína carga(-) por desprotonación. pH solución< pI= proteína carga(+) por protonación pH solución =pI =proteína carga(0) precipitado insoluble

Cromatografía Es un conjunto de técnicas basadas en el principio de retención selectiva, cuyo objetivo es separar los distintos componentes de una mezcla, permitiendo identificar dichos componentes. Volumen de columna Muestra aplicada Matriz Tapón poroso Eluyente Proteínas separadas

Matriz de la columna. Sustancia que está empapada de solvente y que se empaqueta en la columna. También se denomina fase estacionaria o lecho de la columna. Fase Móvil. Solución Tamponada que se hace pasar a través de la columna. Longitud del dispositivo en el que se empaqueta la columna: Es importante en algunos tipos de cromatografía como la de filtración en gel y poco importante en otras como la cromatografía de afinidad. Volumen de la columna. Volumen total de gel que se empaqueta en una columna cromatográfica. Volumen muerto de la columna. Cantidad de solvente que tiene que atravesar la columna para asegurar que se ha reemplazado completamente.

Å kDa MASA TAMAÑO

Cromatografía de exclusión molecular PRINCIPIO: Tamaño de partícula y masa molecular. Mayor masa molecular eluye primero El gel retiene particuas de menor masa molecular

GRANULOS DE UN MATERIAL ESPONJOSO E HIDRATADO APLICACIONES Desalado de proteínas Purificación de proteínas Determinación del peso molecular de las proteínas TIPOS DE MATRIZ GRANULOS DE UN MATERIAL ESPONJOSO E HIDRATADO Dextranos con enlaces cruzados Agarosa Poliacrilamida

FASE ESTACIONARIA En esta práctica se utilizará el gel dextrano. Tipo Peso molecular Límite de fraccionamiento (daltons) Agua retenida (g/g gel sec) Volumen de gel hidratado (ml/g gel seco) G10 Hasta 700 1.0 2 G15 Hasta 1500 1.5 3 G25 1000 - 5000 2.5 5 G50 1500 - 30 000 5.0 10 G75 3000-80 000 7.5 12-15 G100 4000 - 150000 10.0 15-20 G150 5000 – 400 000 15.0 20-30 G200 5000 – 800 000 20.0 30-40

Las proteínas son moléculas cargadas De Suma de las cargas de las cadenas laterales de los aminoácidos Dependen de: pH y pKa; ambiente que los rodea

Cromatografía de intercambio iónico

Intercambio catiónico Fase estacionaria cargada negativamente Intercambio aniónico Fase estacionaria cargada positivamente

GRADIENTE DE CONCENTRACIÓN

Factores que afectan a la retención Fuerza Iónica 2. pH 3. Modificadores Orgánicos

Reconocimiento molecular

Cromatografía de Afinidad

Utiliza la alta especificidad entre las moléculas biológicas para separar componentes específicos de mezclas complejas.

Ejemplo: Proteínas con poli-His

Unión por afinidad y desalado

IOJAP 75 50 37 25 kDa W. Succinogenes 30 kDa M. Genitalium 28 kDa Pellet W. Succinogenes 30 kDa M. Genitalium 28 kDa Flow Wash Pur. Prot.

VENTAJAS: No hay restricción por volumen. Especificidad Pureza del producto final DESVENTAJAS: Precio (alto) Condiciones de elución drásticas Ligando específico no disponible o inadecuado

Desalado

Determinación de la concentración de proteína Métodos espectrofotométricos Ventajas de la técnica Rápida Precisa Versátil Fácil de usar Eficiente en costo

MÉTODO VENTAJAS DESVENTAJAS Método de Absorción No se pierden las muestras Interfieren compuestos que absorben en el UV MÉTODOS COLORIMÉTRICOS Biuret Específico para proteínas, muestra pocas interferencias es barato Poca sensibilidad 1 a 6 mg/mL Lowry Tiene bastante sensibilidad de 0,1-1 mg/mL. No todas las proteínas reaccionan igual. Muestra interferencias con detergentes no iónicos, sulfato de amonio Bradford Muy sensible 0,5 -1,4 mg/mL Muestra interferencias con detergentes

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