CLASE INTRODUCTORIA No. 2: “REPLICACIÓN DEL DNA” GENÉTICA MOLECULAR Lic. Deborah E. Rodríguez

DNA  RNAm  PROTEÍNAS “Es la síntesis del DNA formándose 2 moléculas hijas idénticas a la molécula madre” 27/08/2008

JUSTO ANTES DE LA DIVISIÓN CELULAR. ¿DÓNDE SE LOCALIZA? EN EL NÚCLEO. ¿CUÁNDO OCURRE? JUSTO ANTES DE LA DIVISIÓN CELULAR. ¿DÓNDE SE LOCALIZA? EN EL NÚCLEO. 27/08/2008 Dra. Genoveva Martín MSc. 2008

REGLAS FUNDAMENTALES Es semi conservativa. Empieza en un punto de origen. Ocurre bidireccionalmente. La dirección de lectura es 3’  5’ La dirección de síntesis es 5’  3’ y es semi discontinua. La polimerización es termodinámicamente favorable 27/08/2008

REPLICACIÓN EN PROCARIOTAS MODELOS O TEORÍAS DISPERSIVA CONSERVATIVA SEMICONSERVATIVA

Las cadenas de DNA progenitoras se rompen a intervalos, y las dos moléculas de DNA de doble cadena resultantes (moléculas hijas) presentan fragmentos del DNA progenitor combinados con fragmentos nuevos.

Cada una de las hebras del DNA progenitor se duplica produciendo dos moléculas hijas una de las cuáles es la molécula de DNA progenitora intacta y la otra una molécula de DNA cuyas dos hebras son nuevas.

Se originan dos moléculas de DNA, cada una de ellas compuesta de una hebra del DNA original y de una hebra complementaria nueva. Propuesta por el modelo de Watson y Crick.

REQUERIMIENTOS DE LA REPLICACIÓN MOLDE  Cadena de DNA dúplex. SUSTRATOS: 4 Ribonucleósidos Trifosfatados (ATP, GTP, UTP, CTP) 4 Desoxiribonucleósidos (dATP, dGTP, dTTP, dCTP) Mg2++ ATP Proteínas Estabilizadoras de la Hebra Simple del DNA (SSB).

ENZIMAS PROTEÍNA DNA a HELICASAS TOPOISOMERASAS I Y II (DNA GIRASA) PRIMASA O RNA POLIMERASA DNA POLIMERASAS: DNA POLIMERASA III DNA POLIMERASA I PIROFOSFATASAS DNA LIGASA

ENZIMAS DE LA REPLICACIÓN Proteína DNA a  Separa las cadenas del DNA dúplex. DNA Helicasas  Desenrollan la doble hélice. Proteínas Estabilizadoras del DNA Monocatenario (SSB) Mantienen abierta la hélice. Topoisomerasas I y II  Estabilizan el desenrrollamiento.

ENZIMAS DE LA REPLICACIÓN RNA Primasa  Genera el RNA cebador. RNA Cebador  Permite que empiece a actuar la DNA Pol III. DNA Polimerasas III  Sintetiza las cadenas de DNA. DNA Polimerasa III y I  Corrección de errores. Pirofosfatasas  Aportan la energía necesaria. DNA Ligasa  Une los fragmentos de Okazaki.

INICIACION 2. ELONGACION 3. TERMINACION ETAPAS INICIACION 2. ELONGACION 3. TERMINACION

“Desenrrollamiento y apertura de la doble hélice en el punto ori-c” PRE-INICIACIÓN “Desenrrollamiento y apertura de la doble hélice en el punto ori-c” LOCALIZAR ORIGEN DE REPLICACIÓN Ori C. SEPARAR LAS CADENAS. FORMACIÓN DEL TOPOISÓMERO (-). FORMACIÓN DE LA HORQUILLA DE REPLICACIÓN. Enzimas Que Participan: Proteína dnaA DNA Helicasas Proteínas Estabilizadoras del DNA Monocatenario (SSB) DNA Topoisomerasas I y II Primosoma 27/08/2008

“Desenrrollamiento y apertura de la doble hélice en el punto ori-c” PRE-INICIACIÓN “Desenrrollamiento y apertura de la doble hélice en el punto ori-c” 1- Proteína dnaA separa la molécula doble del DNA formando regiones de cadena simple. 2- DNA Helicasas facilitan el desenrrollamiento de la cadena dúplex. 3- Proteínas SSB se unen a las hebras molde para que no vuelvan a enrollarse. 4- DNA girasa y Topoisomerasas I y II eliminan la tensión generada por la torsión en el desenrrollamiento. 27/08/2008

PROTEÍNA dnaA  20 – 50 monómeros. Se unen a secuencias especificas de nucleótidos en el origen de la replicación (rico en pares de bases de AT)  Ori C (245 pb). Requiere ATP. Separa la molécula doble del DNA formando regiones de cadena simple. La proteína dnaA se une al ori C y a ellos se unen las proteínas dnaB y dnaC, formando un complejo proteico.

PUNTO DE ORIGEN PROCARIOTAS  UNO EUCARIOTAS  MÚLTIPLES 27/08/2008

PROTEÍNAS ESTABILIZADORAS DE LA HEBRA SIMPLE DEL DNA (SSB)  Se unen a la cadena simple cooperativamente, una favorece la unión de las demás. Mantienen el equilibrio entre la cadena simple y la doble del DNA. Mantienen separadas las cadenas y las protegen de las Nucleasas de DNA de cadena simple.

DNA HELICASAS  Se unen al DNA de cadena simple cerca de la horquilla y se mueve a la región de cadena doble forzando la separación y el desenrrollamiento del DNA. Requieren ATP. Cuando las cadenas se separan las SSB se unen evitando que se forme de nuevo la hélice.

TOPOISOMERASAS  Al separarse las cadenas del DNA doble se forman superenrollamientos positivos/ negativos en la región de la horquilla de replicación. Las Topoisomerasas se encargan de remover esos superenrollamientos.

Así, relaja los superenrollamientos acumulados. I  Corta reversiblemente una sola cadena de la doble hélice, pasa la cadena intacta a través de la rotura y resella. Así, relaja los superenrollamientos acumulados. No requieren ATP. Tienen actividades de Nucleasa y de Ligasa. Negativos  E. coli Negativos y Positivos  Eucariotas

Tiene actividades de Nucleasa y de Ligasa. II  DNA GIRASA Corta ambas cadenas de la doble hélice, pasa la cadena intacta a través de las roturas y resella. Así, introduce superenrollamientos negativos en el DNA. Requiere ATP. Tiene actividades de Nucleasa y de Ligasa. 27/08/2008

Agentes Anti cáncer: Etopósido Diana  Topoisomerasa II humana. Agentes Antimicrobianos: Quinolonas Ciprofloxacina  Diana  DNA girasa bacteriana 27/08/2008

“Síntesis del RNA iniciador” INICIACIÓN “Síntesis del RNA iniciador” FORMACIÓN DEL COMPLEJO INICIADOR. FORMACIÓN DEL RNA INICIADOR. UNIÓN DEL PRIMER DESOXIRRIBONUCLEÓTIDO. ENZIMAS QUE PARTICIPAN: Primosoma  Primasa (RNA Pol) + Complejo Proteínas dnaA, dnaB y dnaC. DNA Pol III 27/08/2008

“Síntesis del RNA iniciador” INICIACIÓN “Síntesis del RNA iniciador” Primasa sintetiza la molécula de RNA cebador o Primer. DNA Pol III une el 1er. desoxirribonucleótido al extremo 3’ -OH del cebador. 27/08/2008

PRIMASA O RNA POLIMERASA  Sintetiza de novo secuencias cortas de RNA (5 a 10 nucleótidos) de manera complementaria y antiparalela al molde de DNA. Secuencia de RNA cebador, necesaria para que actúe la DNA Pol III. No tiene actividad correctora. PRIMOSOMA  Es la unión de la Primasa con el complejo de proteínas (dnaA, dnaB y dnaC) que se unen al DNA simple.

DNA Polimerasa III sintetiza las nuevas ELONGACIÓN “Síntesis del DNA” ALARGAMIENTO DE LAS CADENAS DE DNA. HEBRA CONDUCTORA Y HEBRA RETRASADA. PARTICIPAN DNA POL III , DNA POL I, PIROFOSFATASAS Y DNA LIGASA. DNA Polimerasa III sintetiza las nuevas hebras en sentido 5’3’. 27/08/2008

DNA POLIMERASA III (Mg2++) Actividad de Polimerasa 5’  3’  Polimeriza nucleótidos en sentido 5’  3’ (1,000 n/seg.). La cadena matriz 5’  3’ del DNA para que sea copiada debe dar una vuelta “De trombón” para que la DNA Polimerasa pueda desplazarse por ella. Actividad de Exonucleasa 3’  5’  Hidroliza los nucleótidos, que no estén correctamente colocados, en sentido 3’  5’ y rellena. Esto asegura la fidelidad de la replicación.

ELONGACIÓN 27/08/2008

UNIÓN DE LOS NUCLEÓTIDOS Los nucleótidos se unen entre sí mediante por enlaces fosfodiester acción de las enzimas Primasa (RNA Pol), DNA Pol I y III. Se unen enlazando el grupo P5’ de un nucleótido con la posición 3’ del siguiente. Cada nucleótido debe tener tres grupos P para poder ser incorporado a la cadena polinucleotídica.

El nucleótido pierde dos P como pirofosfato (PPi) y se une al azúcar del nucleótido siguiente a través del P restante. Las Pirofosfatasas rompen el enlace del pirofosfato para proporcionar energía a la reacción.

ELONGACIÓN La cadena 3’5’es leída por la DNA polimerasa III de manera continua precedida por RNA cebador (cadena conductora, va en dirección a la apertura de la horquilla). La cadena 5’3’ no puede ser leída directamente, esto se soluciona invirtiendo la cadena y leyéndola en pequeños fragmentos de DNA (Okazaki -1,000 n), precedidos por RNA cebador, que crecen en sentido 5’3’ y que más tarde se unen (cadena retrasada, va en dirección contraria a la apertura de la horquilla). 27/08/2008 Dra. Genoveva Martín MSc. 2008

DNA POLIMERASA I 1- Actividad de Exonucleasa 5’  3’ PARA ELIMINAR AL RNA INICIADOR. Separación de los ribonucleótidos del RNA Cebador y sustitución por los desoxirribonucleótidos correspondientes. 2- Actividad de Polimerasa 5’  3’ PARA SINTETIZAR DNA EN DIRECCIÓN 5’  3’ Rellena los huecos con DNA (10 n/seg.). 3- Actividad de Exonucleasa 3’  5’ PARA EFECTUAR LAS CORRECCIONES. Separación de desoxirribonucleótidos incorrectos y sustitución por los correctos.

DNA LIGASA Sella en forma covalente las brechas del DNA sintetizado por la DNA Pol III y el sintetizado por la DNA Pol I, o sea, une los fragmentos de OKAZAKI. Estos nucleótidos deben estar situados en una estructura de doble cadena y apareados de manera correcta. Requiere ATP  AMP + PPI o NAD+  AMP + NMP

AMBAS CADENAS

TERMINACIÓN “Corrección de Errores” SE REALIZA LA LECTURA DE PRUEBA PARA CORREGIR POSIBLES ERRORES. SE CULMINA LA REPLICACIÓN Y LAS MOLÉCULAS HIJAS DEL DNA SE SEPARAN. REPLICACIÓN SEMICONSERVATIVA. Las enzimas correctoras son la DNA Pol III y la DNA Pol I que corrigen todos los errores cometidos en la replicación o duplicación. 27/08/2008

DNA POL III Y DNA POL I PARA EFECTUAR LAS CORRECCIONES. Actividad de Exonucleasa 3’  5’  Hidroliza los nucleótidos, que no estén correctamente colocados, en sentido 3’  5’ y rellena. Esto asegura la fidelidad de la replicación.

INHIBIDORES DE LA REPLICACIÓN 27/08/2008 Dra. Genoveva Martín MSc. 2008

INHIBIDORES DE LA REPLICACIÓN 1- Bloquean la replicación del DNA al detener la elongación de la cadena, enlenteciendo así la división de células de rápido crecimiento y de los virus. 27/08/2008

separación de las cadenas. ACRIDÍNA, ACTINOMICINA D Y ETIDIO Se intercalan entre las bases y dificultan la separación de las cadenas. BLEOMICINA, NEOCARZINOSTATINA Producen rotura de los enlaces entre los carbonos 3 y 4 de la ribosa. NETROPSINA Y DISTAMICINA A Se unen a zonas ricas en A-T. EJEMPLOS 27/08/2008

DESOXIADENOSINA  DIDANOSINA (ddI) + OH NUCLEÓSIDOS ANÁLOGOS DESOXIADENOSINA  DIDANOSINA (ddI) + OH Se producen al modificar la porción de azúcar del nucleósido. TIMIDINA + N3  ZIDOVUDINA (AZT) AZIDO-3’-DESOXITIMIDINA (AZT)  VIH ARABINÓSIDO CITOSINA (ara C – Cytarabina)  QUIMIOTERAPIA ARABINÓSIDO ADENINA (ara A - Viradabina)  ANTIVIRAL EJEMPLOS 27/08/2008

INHIBIDORES DE LA REPLICACIÓN 2- Actúan sobre las enzimas de replicación (inhibidores específicos)  Forman complejos con el DNA impidiendo su desenrrollamiento y la separación de sus cadenas. 27/08/2008

EJEMPLOS AFIDICOLINA  DNA POLIMERASA NOVOBIOCINA Y ACIDO NALIDÍXICO  DNA GIRASA AFIDICOLINA  DNA POLIMERASA EJEMPLOS 27/08/2008