(2,2-difenil-1-picrilhydrazyl) UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CENTRO DEL PERÚ DETERMINACIÓN DE LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE UTILIZANDO EL RADICAL DPPH ESTABLE (2,2-difenil-1-picrilhydrazyl) CÁTEDRA: ANÁLISIS DE ALIMENTOS CATEDRÁTICO: ING. LUIS ARTICA MALLQUI ALUMNOS: CRISTÓBAL ORÉ, Patricia PATALA SANCHEZ, Maycon SEMESTRE: VI Huancayo- 2015-II FACULTAD DE INGENIERÍA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

INTRODUCCIÓN La excesiva oxidación de biomoléculas da lugar a diversos daños en el organismo. Así, un exceso de radicales libres se ha relacionado con una mayor incidencia de diversas enfermedades degenerativas como cáncer, enfermedades cardiacas, inflamación, artritis, disfunción cerebral, aceleración del envejecimiento, etc. Los Antioxidantes son compuestos los cuales pueden inhibir o retardar la oxidación de otras moléculas inhibiendo la iniciación y/o propagación de las reacciones en cadena de los radicales libres. Para ello existe muchos métodos para medir la capacidad antioxidante de una especie o sustancia, un método muy usado se basa en la estabilidad del radical 1,1-difenil-2-picrilhidrazil (DPPH) la cual se atribuye a la deslocalización del electrón desapareado, esta deslocalización también le otorga una coloración violeta caracterizada por una banda de absorción, en solución etanólica, centrada alrededor de 517 nm. El objetivo del trabajo es: Determinar la capacidad antioxidante de biocomponentes presentes en la ciruela (Prunus domestica)

MARCO TEÓRICO La actividad antioxidante no puede ser medida directamente, pero puede determinarse por los efectos del compuesto antioxidante en un proceso de oxidación controlado. La medición de una muestra oxidante, pueden usarse con base a las reacciones químicas, la gran mayoría de los ensayos para determinar de capacidad antioxidante pueden ser divididos en dos categorías: Ensayos basados en la reacción por transferencia de átomos de hidrógeno (HAT): monitorean una reacción cinética competitiva, generalmente están compuestos de un generador de radical libre sintético, una prueba molecular oxidable y un antioxidante. Ensayos basados en la reacción por transferencia de electrones (ET): involucran una reacción redox con el oxidante como un indicador del punto final de reacción. Entre los ensayos de captación de radicales libres, el método DPPH es el más rápido, es simple (no incluye muchos pasos) y de menor costo en comparación con otros modelos. Por otro lado, el ensayo de decoloración ABTS•+ se puede aplicar a antioxidantes hidrofílicos y lipofílicos). Por lo anterior, estos dos métodos son los más utilizados.

MODELOS DE ENSAYO OJO: Tras el tostado los componentes fenólicos naturales pueden perder actividad, mientras que otros compuestos antioxidantes tales como los productos de reacción de Maillard (PRM), son los responsables del aumento de la capacidad antioxidante.

Ensayo DPPH 𝐷𝑃𝑃𝐻 ∗ + 𝐴𝑂𝐻 → 𝐷𝑃𝑃𝐻−𝐻 + 𝐴𝑂 ∗ . Cuando una disolución de DPPH entra en contacto con una sustancia que puede donar una átomo de hidrógeno o con otra especie radical (R. ) se produce la forma reducida DPPH-H ó DPPH-R con la consecuente pérdida del color y por lo tanto la pérdida de la absorbancia. La reacción entre el DPPH y un antioxidante, podemos representarla de la siguiente manera: 𝐷𝑃𝑃𝐻 ∗ + 𝐴𝑂𝐻 → 𝐷𝑃𝑃𝐻−𝐻 + 𝐴𝑂 ∗

METODOLOGÍA MATERIALES: PIPETAS DE 10mL Y 5mL VASO DE PRECIPITACION DE 100mL FIOLA DE 25mL Y 50mL MORTERO DE VIDRIO TUBO DE ENSAYO CELDAS PARA ESPECTROFOTÓMETRO PAPEL ALUMINIO PAPEL FILTRO MATERIALES:

MATERIAL VEGETAL: CIRUELA EQUIPOS: BALANZA ANALITICA ESTUFA ESPECTROFOTÓMETRO

DPPH (2,2-difenil-1-picrilhydrazyl) REACTIVOS: AGUA DESTILADQA METANOL 80% DPPH (2,2-difenil-1-picrilhydrazyl)

PROTOCOLO: Lavar la ciruela, cortar y poner sobre el papel aluminio. EXTRACCIÓN DEL EXTRACTO: Lavar la ciruela, cortar y poner sobre el papel aluminio. Llevarlo a la estufa por 24-48 horas. Después de sacar de la estufa molerlo bien.

Luego pesar 3,75g de la ciruela molida en un vaso de precipitación previamente cubierto de papel aluminio. Agregar 6,5 mL de metanol al 80%, mezclarlo y taparlo bien con papel aluminio. Después de 24 horas filtrarlo con papel filtro 2 veces y se obtiene el extracto.

Determinación de la capacidad antioxidante: En un tubo de ensayo medir 0.1ml del extracto +4mL de la solución metanólica (80%) de radical DPPH Agregar a 3 celdas y medir en el espectrofotómetro a 517nm, al tiempo 0min. Blanco: metanol 80% Luego de 16min volver a medir en el espectrofotómetro, las celdas deben estar en fase oscura. Hallar el % de inhibición del radical DPPH.

𝑂𝑋𝐼𝐷𝐴𝑁𝑇𝐸 𝐷𝑃𝑃𝐻 + 𝐴𝑁𝑇𝐼𝑂𝑋𝐼𝐷𝐴𝑁𝑇𝐸 → 𝑂𝑋𝐼𝐷𝐴𝑁𝑇𝐸 𝑅𝐸𝐷𝑈𝐶𝐼𝐷𝑂 + 𝐴𝑁𝑇𝐼𝑂𝑋𝐼𝐷𝐴𝑁𝑇𝐸 𝑂𝑋𝐼𝐷𝐴𝐷𝑂

RESULTADOS ABSORBANCIA MEDIDA EN t=0min y t=16min

Hallando el % de inhibición: % 𝐷𝐸 𝐼𝑁𝐻𝐼𝐵𝐼𝐶𝐼Ó𝑁= 𝐴 𝐶 0 − 𝐴 𝐴 𝑡 𝐴 𝐶 0 𝑥100 % 𝐷𝐸 𝐼𝑁𝐻𝐼𝐵𝐼𝐶𝐼Ó𝑁= 2.408−1.657 2.408 𝑥100 % 𝐷𝐸 𝐼𝑁𝐻𝐼𝐵𝐼𝐶𝐼Ó𝑁=31.188% 𝐷𝐸 𝐼𝑁𝐻𝐼𝐵𝐼𝐶𝐼Ó𝑁 𝐷𝐸𝐿 𝑅𝐴𝐷𝐼𝐶𝐴𝐿 𝐷𝑃𝑃𝐻 DONDE: 𝐴 𝐶 0 = Absorbancia del control en el instante t= 0min 𝐴 𝐴 𝑡 = absorbancia de los antioxidantes en t=16min

CONCLUSIONES DISCUSIONES Para determinar la actividad antioxidante por el ensayo DPPH , el rango de longitudes de onda varía entre los 515 y 540 nm; para este trabajo se midió a 517 nm donde presenta su máxima absorción. La solución de DPPH se preparaba minutos antes de realizar el ensayo, debido a que tiende a degradarse rápidamente por efectos de la luz y la temperatura. El porcentaje de inhibición de la ciruela es 31.188% DISCUSIONES El % de inhibición de la ciruela es aceptable, ya que se considera mayor a 25% según bibliografías, en un archivo de la Universidad Simón Bolívar- Uruguay el % de inhibición usando el mismo método le dio 30.5%.

Ensayo ABTS (Acido 2,2′-azino-bis-3-etilbenzotiazolin-6- sulfonico) La generación del radical ABTS●+ constituye la base de uno de los métodos espectrométricos que han sido aplicados para medir la actividad antioxidante total de soluciones o sustancias puras y mezclas acuosas. El ensayo original de ABTS●+ estaba basado en la activación de la metilmioglobina con peróxido de hidrógeno en presencia de ABTS para producir un radical catión, en presencia o ausencia de antioxidantes. Este fue criticado debido a que la reacción rápida de los antioxidantes, contribuye a la reducción del radical ferrilmioglobina. Un formato más apropiado para el ensayo consiste en la técnica de decoloración, en la cual el radical es generado directamente en una forma estable antes de la reacción con los antioxidantes.

REFERENCIAS: DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE DIVERSAS PARTES DEL ÁRBOL Nicotiana Glauca- MEXICO, disponible en: http://www.uaq.mx/investigacion/difusion/veranos/memorias-2008/7VeranoUAQ/14MunozJuarez.pdf DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE POR DPPH Y ABTS DE 30 PLANTAS RECOLECTADAS EN LA ECOREGION CAFETERA- COLOMBIA (2013), disponible en: http://repositorio.utp.edu.co/dspace/bitstream/11059/3636/1/54763T736.pdf EFECTO DEL PROCESAMIENTO SOBRE LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE DE LA CIRUELA CRIOLLA (PRUNUS DOMESTICA)- URUGUAY (2012), disponible en: http://www.scielo.org.ve/pdf/alan/v62n4/art07.pdf EVALUACIÓN DE LA TÉCNICA 2,2-DIFENIL-1-PICRILHIDRAZILO (DPPH) PARA DETERMINAR CAPACIDAD ANTIOXIDANTE- PERÚ (2014), disponible en: http://www.scielo.org.pe/pdf/hm/v15n1/a08v15n1.pdf OPTIMIZACIÓN DEL MÉTODO CAPTACIÓN DEL RADICAL 2,2- DIFENIL-1-PICRILHIDRAZILO (DPPH) PARA EVALUAR ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE EN BEBIDA DE CAFÉ- ESPAÑA (2012), disponible en: http://revistas.um.es/analesvet/article/viewFile/188731/155461

GRACIAS