MICROSCOPIO CONFOCAL Brenda Anaid Rubio Velázquez

Antecedentes: El científico estadounidense Marvin Minsky al estudiar el sistema nervioso pensó que si podía verlo en sus diferentes niveles podría entender como funcionaban los circuitos neuronales. Así Marvin Minsky construyo y patento su técnica llamado “Microscopio de Barrido por Etapas de Doble Enfoque” que le permitió observar con claridad capas sucesivas de una muestra sin rebanar en cortes finos. Marvin Minsky (1927- )

Treinta años después, su método es conocido como “Microscopia de Barrido Confocal”, éste: Combina el microscopio de fluorescencia con la imagen electrónica Además de puntos de luz suministrados por laser dirigido al espécimen en particular para obtener imágenes tridimensionales.

Solución del Problema… Microscopio Óptico Convencional: Utiliza combinaciones en diferentes longitudes de onda como fuente luminosa capaz de iluminar una amplia zona de la muestra. Relativa gran profundidad de campo. Sin enfocar, aparecen visibles imágenes en cualquier profundidad de la muestra. La imagen completa será: Borrosa Confusa Demasiado abarrotada La solución al problema es el “Microscopio Confocal de Barrido por Láser o Microscopio Confocal”

Principio de la microscopía confocal Microscopio óptico que incluye como fuente de luz un láser y un sistema electrónico que ayuda a la captura de imágenes. El principio de la microscopia confocal se basa en eliminar la luz reflejada o fluorescente procedente de los planos fuera de foco. Toma el haz luminoso que proviene del plano focal, eliminándose los haces procedentes de los planos inferiores y superiores 

El haz de luz láser que se hace pasar a través del pinhole, este haz de luz pasa a través del espejo. Posteriormente el haz pasa a través del lente del objetivo el cual lo enfoca sobre la muestra. La luz emitida por la muestra es recibida por el lente objetivo y reflejada por el espejo dicroico que refleja totalmente la luz que llega a 45º.Esta luz pasa a través de la apertura pinhole que no permite el paso de la fluorescencia originada por los planos fuera de foco.

Al iluminar con precisión sólo un plano de la muestra, la intensidad de iluminación disminuye con rapidez por arriba y por debajo del plano del foco y aleja la luz de otros planos diferentes al focal. Con muestras relativamente gruesas pueden observarse varias capas val ajustar el plano del haz láser.

Ventajas del Microscopio Confocal Mayor resolución Apertura numérica 1.4 Longitud de onda 442 nm Resoluciones de 0.14 nm en horizontal y 0.23 nm en vertical. Mayor contraste Posibilidad de realizar secciones ópticas Uso de fluorescencia Enfoca en un sólo plano Análisis de imágenes Realce de imágenes Mejorar su calidad Combinación de imágenes Reconstrucción en tres dimensiones Imágenes multidimensionales

b) a) Microscopio Confocal por láser. (a) Imagen confocal de una comunidad bacteriana mixta de biofilm cultivado en laboratorio. Las células bacilares verdes son Pseudomonas aeruginosa. Otras células de diferentes colores aparecen a diferentes profundidades dentro del biofilm. (b) Micrografía confocal de una cianobacteria filamentosa creciendo en un lago carbonatado. Las células tienen un diámetro de alrededor de 5μm.

a) b) Imágenes confocales a varias profundidades de un biofilm. (a) a 20μm de profundidad. (b) 40 μm. Cada una de estas imágenes confocales- que combinan imágenes fluorescentes y de reflexión- tienen profundidad de campo de 2 μm. Se pueden observar algunas bolas de látex fluorescentes, en rojo empleadas como trazadoras.

Componentes del Microscopio Confocal Espejo dicroico: Refleja totalmente la luz que incide con un ángulo de 45º. Ranura detectora Pinhole: Permite el paso de luz reflejada del plano focal. Lente objetivo: Permite enfocar el rayo de luz refractado por el espejo dicroico hacia el plano focal de la muestra. Detector: recibe el haz de luz y genera la imagen.

Tratamiento de la Muestra A menudo se tiñen con colorantes fluorescentes. Las muestras se marcan con fluorocromos. Otro método consiste en ajustar el microscopio en forma tal que se obtenga diferentes capas con diferentes colores.

Utilidades Permite localizar anticuerpos para estudios de inmunocitoquímica con mayor resolución. Monitoriza los movimientos de moléculas dentro de las células. Estudios de ADN y ARN. Procesos celulares. Investigación biomédica. Campo Biología Celular.

Resumen… Microscopio Confocal Fuente de iluminación Láser () Tipo de lente En forma circular (resolución 1/1.4) o anular (resolución 1/1.75) Aumento Máximo 1500 Limite de resolución 100-200 Características Emplea un haz de luz láser. Combina un microscopio de fluorescencia con imágenes digitalizadas. Enfoca en un solo plano. Captura imágenes multidimensionales y a diferentes profundidades. Tratamiento de la muestra Se marcan con fluorocromos.

Referencias bibliográficas Microbiología Medica. Jawetz, Melnick y Adelberg. Mc Graw Hill.25ª edición. México. Páginas 10-11 Biología de los microorganismos. Madigan, Martinko y Clark. Duodécima edición. Pearson. México. Microbiología. Prescott. Mc Graw Hill. Quinta edición. México. http://www.vet.unicen.edu.ar/html/Departamentos/Samp/Microbiologi a/Microcopia%20de%20laser%20confocal%20PDF.pdf http://www.medic.ula.ve/histologia/anexos/microscopweb/MONOWEB /capitulo6_7.htm