Inmovilización covalente de la enzima Lacasa de Trametes maxima en soportes base agarosa aplicando diseño racional (DRDI) Bessy V. Cutiño-Avila1 María I. Sánchez-López2, Gilda Guerra2, Miguel Ramos2, Alberto del Monte-Martínez2 1 Laboratorio de Tecnología Enzimática, Centro de Estudio de Proteínas, Facultad de Biología, Universidad de La Habana, La Habana, Cuba. Email: adelmonte@fbio.uh.cu 2 Laboratorio de Biotecnología, Departamento de Microbiología, Facultad de Biología, Universidad de La Habana, La Habana, Cuba 1 1 1 1 1

Contaminación de las aguas con efluentes de la Industria Textil Introducción Contaminación de las aguas con efluentes de la Industria Textil El desarrollo industrial de las últimas décadas ha implicado la liberación de grandes cantidades de compuestos químicos residuales, de elevada toxicidad y limitada posibilidad de biodegradación, a los ecosistemas naturales. La Industria Textil es una de las que genera mayores volúmenes de aguas residuales, con un elevado contenido de colorantes, químicos auxiliares, sales, ácidos, bases y ocasionalmente metales pesados. Esteve-Núñez y cols., 2001; Asgher y cols., 2008; Mishra y Kumar, 2009; Prasad y Rao, 2010; Vaithanomsat y cols., 2010

Tratamientos de efluentes de la Industria Textil Introducción Tratamientos de efluentes de la Industria Textil Métodos Químicos Métodos Físicos Procesos oxidativos con peróxidos El tratamiento con ozono Las reacciones fotoquímicas La destrucción electroquímica Intercambio iónico Filtración por membrana Irradiación Coagulación electrocinética EFECTIVOS Pero!!! Muy costosos Acumulan grandes cantidades de lodo residual Requieren altos niveles de energía En muchas ocasiones, los productos de la degradación son tóxicos Zouari- Mechichi y cols., 2006; Erkurt y cols., 2007; Raghukumar y cols., 2008

Complejo Multienzimático: Introducción Tratamientos biológicos de eflcuentes de la Industria Textil El tratamiento de residuales empleando hongos y bacterias ofrecen las siguientes ventajas: Son más baratos No dañan el medio ambiente Producen pocas cantidades de lodos Complejo Multienzimático: Lacasa Manganeso Peroxidasa Lignina Peroxidasa Remoción de colorantes en los residuales textiles Hongos basidiomicetos de la podredumbre blanca Tauber y cols., 2005; Vaithanomsat y cols., 2010; Enayatzamir y cols., 2010

Diseño Racional de Derivados Inmovilizados (RDID) Introducción Diseño Racional de Derivados Inmovilizados (RDID)

Resultados y Discusión Predicción de la configuración más probable en el derivado inmovilizado de lacasa y el pH de inmovilización óptimo Derivado Inmovilizado No. Residuos por Clúster cCP DA %CC %CCP Supp.CC Lac-Glyoxyl pH 7,0 1 NTerm-K192-K194 0,98 63° 30,07 29,94 29,94 % 2 K324-K475 0,01 126° 0,0 3 K59 114° Lac-MANA pH 5,0 D7-D42-D96-D128-D138-D142-D143-D282 0,37 2° 97,78 37,17 60,34 % CTerm-D364-D486-D492 0,23 40° 55,6 12,78 D323-D364-D470-D473 0,17 35° 61,15 10,39 4 D234-D255-E288 0,15 65° 27,85 3,9 5 D435 0,04 180° 6 D180 0,05 120°

Lac-Glyoxyl-Sepharose CL 4B Resultados y Discusión Predicción de la configuración más probable en el derivado inmovilizado de lacasa y el pH de inmovilización óptimo Lac-Glyoxyl-Sepharose CL 4B

Resultados y Discusión Predicción de la configuración más probable en el derivado inmovilizado de lacasa y el pH de inmovilización óptimo Lac-MANA-Sepharose CL 4B

Resultados y Discusión Optimización de la carga de proteína a inmovilizar Para la optimización de la carga de proteína a inmovilizar se calcularon los parámetros mMQ, tMQ, EOC y eMQ. DM (Å) mMQ (µmol·mL-1) tMQ (mg·mL-1) OEC eMQ (mg·mL-1) 65,6 0,81 43,24 0,28 12,13 La lacasa de Trametes maxima no es un proteína pequeña La relación óptima MD/PD (1/20) no se cumple El sistema estará restringido difusionalmente (OEC < 0,45) Explica las diferencias entre la tMQ y la eMQ

Inmovilización de la enzima lacasa de Trametes maxima Resultados y Discusión Inmovilización de la enzima lacasa de Trametes maxima Una vez llevada a cabo la inmovilización se compararon los resultados con las predicciones de la optimización in silico de la inmovilización de esta enzima en los dos soportes ensayados. Derivado Inmovilizado eMQ (mg·mL-1) pMQ ALacInicial (U·mL-1) ALacInmov. tRA Act. Expresada Supp.CC Lac-Glyoxyl 12,13 11,70 103,13 36,09 32,5 35 % 29,94 % Lac-MANA 11,20 70,13 65,5 68 % 60,34 % Con los resultados experimentales se corroboró que el soporte MANA-Sepharose CL 4B es el ideal para la inmovilización de la enzima lacasa de Trametes maxima con un porcentaje de actividad expresada del 68 %.

Resultados y Discusión Capacidad decolorativa del derivado inmovilizado Se realizaron experimentos de bioconversión de colorantes con el biocatalizador inmovilizado Lac-MANA-Sepharose CL 4B. Estudios de adsorción inespecífica de los colorantes a los soportes Azul ácido 62 (AB 62) Intra-ácido azul EB (IB EB) Intra-ácido marino TR (IN TR) Lac-MANA-Sepharose CL 4B

Estudios de Bioconversión Enzimática de Colorantes Resultados y Discusión Estudios de Bioconversión Enzimática de Colorantes AB 62 IB EB IN TR Los resultados obtenidos con la aplicación del programa RDID1.0 como implementación de la estrategia de diseño racional en la síntesis de derivados inmovilizados permite disponer de biocatalizadores Lac-MANA-Sepharose CL 4B optimizados, con una elevada retención de actividad funcional y alta estabilidad operacional que posibilita la aplicación de procedimientos propios y atractivos por su eficiencia en la decoloración de colorantes en efluentes de la industria textil.