EXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN DE ANTICUERPOS RECOMBINANTES Curso de Doctorado: Metodologías de generación y expresión de anticuerpos TEMA 7 EXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN DE ANTICUERPOS RECOMBINANTES García-Suárez MM

SISTEMAS PARA LA EXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN DE ANTICUERPOS RECOMBINANTES PRODUCCIÓN A GRAN ESCALA Y BAJO PRECIO MODIFICACIONES POST-TRADUCCIÓN PURIFICACIÓN VIRUS ENDOTOXINA GLICOSILACIÓN PUENTES DISULFURO PROCARIOTAS FRAGMENTOS DE ANTICUERPO USO TERAPÉUTICO DIAGNÓSTICO IN VIVO PÉRDIDA DE AFINIDAD REACCÓNES INMUNES

OPTIMIZAR LA EXPRESIÓN DE ANTICUERPOS RECOMBINANTES NÚMERO DE COPIAS DEL GEN NÚMERO DE COPIAS DEL VECTOR ESTABILIDAD SISTEMAS HOK/SOK (HOST KILLING/SUPPRESSOR OF KILLING) CANTIDAD DE RNA MENSAJERO PROMOTORES FUERTES T7, polh, CMV TRANSPORTE DEL ANTICUERPO SECUENCIAS SEÑAL PERIPLASMA SOBRENADANTE PLEGAMIENTO DEL ANTICUERPO PUENTES DISULFURO ANTICUERPO FUNCIONAL MUTACIONES EN LAS FRs

VECTORES PARA EL DESPLIEGUE DE ANTICUERPOS EN FAGOS FILAMENTOSOS pIII Partícula viral de M13 tipo salvaje pVIII scFv Tipo 3 Vectores fágicos Partícula no viable en el caso de anticuerpos Tipo 8 Tipo 3 + 3 Fagémidos El fago helper aporta pIII y pVIII salvajes Tipo 8 + 8 Tipo 33 gIII y gVIII se incluyen en el genoma del fago Vectores fágicos Tipo 88

VECTORES PARA EL DESPLIEGUE DE ANTICUERPOS EN EL FAGOS NO FILAMENTOSOS fago T7 scFv

EXPRESIÓN DE FRAGMENTOS DE ANTICUERPO EN E. coli EN EL ESPACIO PERIPLÁSMICO EN EL CITOPLASMA DE CEPAS trxB- ox red sig Fab, scFv Lisis parcial de la membrana externa S-S ox red/ox Fab, scFv trxB- S-S S-SH funcional, oxidado H soluble, no funcional insoluble, reducido COMO CUERPOS DE INCLUSIÓN PERIPLÁSMICOS COMO CUERPOS DE INCLUSIÓN CITOPLÁSMICOS ox red sig Fab, scFv in vitro refolding ox red Fab, scFv in vitro refolding

VECTORES PARA LA EXPRESIÓN DE ANTICUERPOS RECOMBINANTES EN BACTERIAS EXCISIÓN

VECTORES PARA LA EXPRESIÓN DE ANTICUERPOS RECOMBINANTES EN E. coli

EXPRESIÓN DE ANTICUERPOS EN CÉLULAS DE MAMÍFERO EXPRESIÓN TRANSITORIA EN CÉLULAS COS EXPRESION ESTABLE EN CÉLULAS CHO Y LÍNEAS DE MIELOMA MURINO

EXPRESIÓN DE ANTICUERPOS EN BACULOVIRUS pAC-K-CH3/pAc-L-CH3 Ck o Cλ K o λ leader P10 polihedrina H CH1 CH2 CH3 BamHI HindIII SacI XhoI XbaI NheI VL VH Virus de la poliedrosis nuclear múltiple de Autografia californica AcMNPV K o λ leader polihedrina H CH2 CH3 BamHI EcoRV SacI P10 XbaI XhoI SpeI Fd region Light chain pAc-K-Fc/pAC-L-Fc

EXPRESIÓN INTRACELULAR DE ANTICUERPOS: INTRABODIES membrana plasmática gp160 IL-2R ErbB2 EGRF KDEL intrabodies citosol ER lumen citosol P21 ras Tat Rev RR NLS Tat núcleo ER Golgi

OBTENCIÓN Y DISTRIBUCIÓN DE INTRABODIES

PURIFICACIÓN DE ANTICUERPOS RECOMBINANTES PROTEÍNA A PROTEÍNA G PROTEÍNA L CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD INTERCAMBIO IÓNICO EXCLUSIÓN MOLECULAR   rProtein L Protein A Protein G Human IgG +++ Human IgM + - Human IgA kappa light Fab scFv Mouse IgG ++ Bovine IgG  

PURIFICACIÓN DE FRAGMENTOS DE ANTICUERPO a. columnas de afinidad con el antígeno b. IMAC c. tags en cl carboxilo terminal d. tags en el amino terminal Clones con el plásmido Crecimiento a baja tª e inducción de la expresión pellet French press fraccionamiento sobrenadantes Columna de afinidad con el antígeno o Columna con iones metálicos (IMAC)