Bioenergética, Enzimas, Metabolismo…. Curso de Bioquímica y Biología Molecular para la maestría de Bioinformática Bioenergética, Enzimas, Metabolismo…. Dra. Laura Castro Departamento de Bioquímica, Facultad de Medicina Universidad de la República

Metabolismo celular

Bioenergética Leyes de la termodinámica Relación entre la energía libre estándar y la constante de equilibrio Energía libre y su dependencia con la concentración de reactivos y productos Transferencia de grupos fosfato y rol del ATP Reacciones de óxido reducción y obtención de energía

Bioenergética: es el estudio cuantitativo de las transferencias energéticas que se producen en las células así como la naturaleza y función de los procesos químicos implicados en estas transferencia de energía. Leyes de la Termodinámica: Primera ley o principio de la conservación de la energía: en cualquier cambio físico o químico, la cantidad total de energía del universo permanece constante. Segunda ley: en todo los procesos la entropía del universo se incrementa o la entropía de un sistema aislado tenderá a aumentar hacia un valor máximo.

SISTEMA + ENTORNO= UNIVERSO Definiciones SISTEMA: Es la porción de universo que tomamos como objeto de estudio. Existen tres tipos de sistemas: SISTEMAS AISLADOS (no intercambia materia ni energía) SISTEMAS CERRADOS (no intercambia materia si energía) SISTEMAS ABIERTOS (intercambia materia y energía) ESTADO DE UN SISTEMA: es el conjunto de propiedades que permiten definirlo (ej.: P, V, T) SISTEMA + ENTORNO= UNIVERSO ¿Qué tipo de sistema es una célula?

Algunas definiciones: Entalpía H o entalpía, expresa el contenido de calor en una reacción a presión constante, se mide como la diferencia entre: H(productos) – H(reactivos) = H Cuando se libera calor se dice que es una reacción exotérmica y H es negativo ya que el contenido de calor de los productos es menor que los reactivos; si la reacción absorbe calor del medio se habla de una reacción endotérmica y H es positivo. H es equivalente a E cuando no hay cambios de volumen. Energía Libre G o energía libre de Gibbs, expresa la cantidad de energía capaz de realizar trabajo, se mide como la diferencia de energía entre G(productos) – G(reactivos) = G, si G es negativo si dice que es una reacción exergónica, si G es positivo la reacción es endergónica. Entropía S o entropía, es una magnitud del desorden en un sistema, cuando los productos son menos complejos y más desordenados que los reactivos la entropía aumenta, S(productos) – S(reactivos) = S

Estas magnitudes (bajo condiciones de temperatura y presión constantes) están relacionadas entre si de acuerdo con la siguiente ecuación: G = H - T S energía libre entalpía entropía donde T es la temperatura absoluta (en grados K). Todo proceso esta termodinámicamente favorecido cuando G es negativo o es exergónico, cuando G = 0 el proceso esta en equilibrio.

Glucosa + 6O2 6CO2 + 6H20 Go = -2823 KJ/mol ¿Por qué la glucosa no reacciona espontáneamente con el oxígeno? G  O exergónica espontánea  O endergónica, no posible  O en equilibrio Glucosa + O2 G* G G CO2 + H20 Coordenadas de la reacción El G representa el máximo de trabajo útil que puede proporcionar una reacción. Para el caso de la glucosa podríamos obtener hasta 2823 kJ por mol de glucosa oxidada hasta CO2 y H2O.

- + entalpía negativa, reacción exotérmica Negativo G = H - T S H S G - + entalpía negativa, reacción exotérmica Negativo y S positivo, aumenta la entropía. + - reacción endotérmica y disminuye la Positivo entropía (a cualquier temp) - - reacción favorecida por el H pero no Puede ser + o - favorecida por el S (favorable a bajas temp) + + reacción endotérmica pero se favorece Puede ser + o - por aumento de la entropía (favorable a altas temp)

Contribución de S y H a las reacciones químicas Cambios favorables de S y H Reacción dirigida por H Reacción dirigida por S

Dependencia de G con la concentración de reactivos y productos A + B C + D CH3COOH CH3COO- + H+ [C][D] [CH3COO-][H+] Keq = Ka = [A][B] [CH3COOH] Ka = 1.74 x 10-5 Cuando se alcanza el equilibrio, el valor de G = O

El potencial químico de una sustancia esta determinado por: GA = GoA + RT ln[A] donde GoA es el potencial químico en condiciones estándar A + B C + D G = G productos - G reactivos (GC + GD) (GA + GB) [C][D] [Productos] G = GO + RT ln = GO + RT ln [A][B] [Reactivos] Go es la energía libre en condiciones estándar, 1 M de reactivos y productos, 25oC R = 8.314 J/K.mol T = temperatura absoluta en oK

¿Qué sucede cuando se alcanza el equilibrio? G = 0  Go = - RT ln Keq también se puede escribir Keq = e - Go / RT

Un ejemplo sencillo: A B donde [B]eq = 0.8 y [A]eq = 0.2, por lo tanto Keq = 4, Go = - RT ln Keq = - 0,00831 x 298 ln 4 = - 3.4 kJ/mol A 100% 50 20 0% B 0% 50 80 100% G ¿Cuál sería el cambio de Go o G estándar en este gráfico? Go

¿Cómo se aplican estos principios en el metabolismo celular? La primera reacción de la glucólisis es la formación de glucosa-1-fosfato a partir de glucosa, esta es una reacción desfavorable desde el punto de vista termodinámico: Glucosa + Pi Glucosa-6-fosfato + H2O Go = +13.8 kJ/mol para hacer esta reacción posible se acopla con la hidrólisis de ATP, ATP + H2O ADP + Pi Go = -30.5 kJ/mol Glucosa + Pi Glucosa-6-fosfato + H2O Go = +13.8 kJ/mol ATP + H2O ADP + Pi Go = -30.5 kJ/mol Glucosa + ATP Glucosa-6-fosfato + ADP Go = -16.7 kJ/mol

Reacciones acopladas

Reacciones acopladas Una cantidad termodinámica (ej: G, H o S) nos indica que una reacción es permitida, A  B está “permitida”; B  A no es espontánea, a menos que se le acople otra reacción favorecida (ej: ATP  ADP) Sin embargo, para que la reacción se produzca, la energía neta debe descender (i.e., G total debe ser negativa.)

Reacciones acopladas

Glucosa + 6O2 6CO2 + 6H20 si Ho = -2816 kJ/mol y So = +0.181 kJ/mol ¿Cuál es el valor de Go a 37oC? ¿Si se aumenta la temperatura, puede TSo igualar a Ho y hacer Go cero ? ¿Si el Go de hidrólisis de ATP es -31 kJ/mol, cuál es el máximo de moles de ATP que se podrían generar si se acopla a la oxidación completa de glucosa la síntesis de ATP a partir de ADP y Pi? 1) Go = Ho - TSo = - 2816 – (310º x 0.181 ) = - 2872 kJ/mol 2) No, es imposible porque So es + 0.181 y - T So siempre será un valor negativo 2872 kJ/mol / 31 kJ/mol = 92.6 ATP !! ¿Cuál es el rendimiento a nivel biológico? 38 ATP o sea 41 %

Glucosa Glucosa-6-P Fructosa-6-P Piruvato Glucosa-6-P Fructosa-6-P Go = + 1.7 kJ/mol ¿Cuál es la Keq de esta reacción? 83 µM 14 µM concentraciones intracelulares Gº’ = -RT ln Keq Keq = e - Gº’ / RT = 0.52 Quiere decir que el equilibrio hay [F6P]/[G6P] = 0.52 o sea hay 34% de F6P y 66% de G6P ¿Qué sucede en la célula? [14x10-3M] G = +1.7 kJ/mol + 0.0083 kJ//K.mol x 310oK ln = -2.9 kJ/mol [83x10-3M]

Definiciones Metabolismo: actividad celular muy coordinada y dirigida en la que muchos sistemas multi-enzimáticos cooperan para cumplir 4 funciones: obtener energía química a partir de nutrientes ricos en energía convertir moléculas nutrientes en moléculas características de la propia célula polimerizar precursores monoméricos a proteínas, ácidos nucleicos, lípidos, polisacáridos y otros Sintetizar y degradar biomoléculas requeridas en funciones celulares especializadas

Definiciones Cinco características principales del metabolismo: Las vías metabólicas son irreversibles Las vías anabólicas y catabólicas deben ser diferentes Cada vía metabólica tiene un primer paso limitante Todas las vías metabólicas están reguladas finamente En los eucariotas las vías metabólicas transcurren en localizaciones celulares específicas

COMPUESTOS FOSFATO DE “ALTA ENERGÍA”

Ciclo del ATP

Factores que influyen en el DG de hidrólisis del ATP Repulsión electrostática Estabilización por resonancia del Pi saliente Ionización del ADP Mayor solvatación de ADP + Pi que ATP DG = DGo’ + RT ln [ADP][Pi] [ATP] [ADP] = 0,25 x 10-3 M [Pi] = 1,65 x 10-3 M [ATP] = 2,25 x 10-3 M DG = -51,8 KJ/mol

Flujo de grupos fosfato

Estabilización por resonancia de los fosfatos

Topografía del metabolismo Citosol: Glucólisis, ruta de las pentosas, síntesis de ácidos grasos, síntesis de nucleótidos, reacciones de gluconeogénesis Núcleo: replicación de DNA, síntesis de tRNA, mRNA, y de proteínas nucleares Gránulos de glucógeno: síntesis y degradación de glucógeno Nucléolo: síntesis de RNA ribosómico Lisosoma: enzimas hidrolíticas Mitocondria: Ciclo de Krebs, fosforilación Oxidativa, oxidación de ácidos grasos, catabolismo de aminoacidos Reticulo endoplasmico: síntesis de lípidos Ribosomas: síntesis de proteínas Golgi: Maduración de glucoproteínas, Formación de membranas

Oxidaciones y Generación de Energía Celular Durante el metabolismo celular se producen oxidaciones de los sustratos metabólicos (con la concomitante reducción de intermediarios) y estas reacciones se utilizan para obtener energía. Un compuesto que se oxida cede electrones (reductor) Un compuesto que se reduce recibe electrones (oxidante) Ejemplo: Fe2+ + Cu2+ Fe3+ + Cu1+ Hay dos semi reacciones: Fe2+ Fe3+ + 1e- oxidación Cu2+ + 1e- Cu1+ reducción Al igual que los ácidos y las bases, siempre que hay una oxidación (perdida de electrones) debe haber una reducción (ganancia de electrones). ¿Quién se lleva los electrones?

Potencial Redox E0 1 M X 1 M XH2 1M H+ salt bridge 1 M H+ 1 atm H2 Condiciones Standard : 1 M Comparado al par de referencia: 2H+ + 2e- <--> H2 (arbitrariamente cero). Se mide un E0 en voltios

NAD+ + 2e- + H+ NADH E´o = - 0.320 V Molécula que participa en las reacciones redox intracelulares NAD+ + 2e- + H+ NADH E´o = - 0.320 V

¿Quién se lleva los electrones? A diferencia del G, cuanto más grande y positivo el potencial redox (Eo), mayor la tendencia a aceptar electrones (actuar como agente oxidante). Hay una relación directa entre el potencial redox y la energía libre: G0 = -n F E0 Donde E0 = Eo(aceptor)- Eo(donador) n = número de electrones F constante de Faraday 96.5 kJ/mol.V Un valor de E positivo generará valores de G negativos

Oxidación de NADH por oxígeno NADH + H+ + 1/2O2 NAD+ + H2O Ejemplo: Oxidación de NADH por oxígeno NADH + H+ + 1/2O2 NAD+ + H2O Las dos semi-reacciones serían: NAD+ + H+ + 2e- NADH + H+ EO = -0.32 V 1/2O2 + H+ + 2e- H2O EO = +0.82 V Usando G0 = -n F E0 G0 = - (2).(96.5 kJ/mol.V){0.82 V –(-0.32V)} = - 220 kJ/mol

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Enzimas A. Propiedades generales de las enzimas B. Principios fundamentales de su acción catalítica C. Introducción a la cinética enzimática D. Enzimas reguladores 45

A. Propiedades generales de las enzimas (I) Son los catalizadores de las reacciones químicas en los sistemas biológicos Aceleran muchísimo la velocidad de las reacciones (106 – 1014 veces). Poseen un elevado grado de especificidad de sustrato La actividad catalítica depende de la integridad de la estructura nativa así como del pH y temperatura. 46

A. Propiedades generales de las enzimas (II) 5. La mayoría de las enzimas son proteínas: La función depende de la integridad de la conformación proteica nativa Existen enzimas que son proteínas simples y otras que requieren componentes químicos adicionales: - Cofactores: - iones inorgánicos (Fe2+, Mg2+, Mn2+ o Zn2+) - complejos orgánicos o metaloorgánicos (coenzimas) Los cofactores unidos covalentemente: grupos prostéticos Holoenzima / Apoenzima 47

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A. Propiedades generales de las enzimas (III) Las enzimas se clasifican según la reacción catalizada: Nomenclatura: - Número clasificatorio de 4 dígitos (E.C.) - Nombre sistemático - Nombre trivial ATP + D-Glucosa ADP + D-Glucosa-fosfato Número clasificatorio: E.C. 2.7.1.1. 2. Clase: Transferasa 7. Subclase: Fosfotransferasa 1. Fosfotransferasas con OH como aceptor 1. D-glucosa como aceptor del fosfato Nombre sistemático: ATP:glucosa fosfotransferasa Nombre trivial: hexoquinasa Nomenclatura: se adiciona sufijo “asa” al nombre del sustrato o de la reacción que cataliza 50

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Enzimas A. Propiedades generales de las enzimas B. Principios fundamentales de su acción catalítica C. Introducción a la cinética enzimática E. Enzimas reguladores 52

B. Principios fundamentales de la acción catalítica de las enzimas ¿ cómo funcionan las enzimas ? En condiciones fisiológicas las reacciones sin catalizar tienden a ser lentas (estabilidad de biomoléculas) Muchas reacciones bioquímicas suponen situaciones poco probables Una enzima soluciona estos problemas proporcionando un ambiente tridimensional favorable a la reacción (sitio activo) 53

El rasgo distintivo de una reacción enzimática es que tiene lugar dentro de un pequeño lugar de la enzima: el sitio activo La molécula fijada en el sitio activo, sobre la que actúa la enzima, se denomina sustrato 54

Las enzimas alteran las velocidades de reacción pero no los equilibrios (B) E + S ES EP E + P (A) S P (A) (B) 55

Las velocidades de reacción y los equilibrios tienen definiciones termodinámicas precisas Equilibrio de reacción depende ΔG’o Velocidad de reacción depende de ΔG‡ S P Keq’ = [P] [S] DG’o = - RT ln Keq’ KT V = k [S] k = e - DG‡ / RT h K = constante de Boltzmann h = constante de Planck 56

Las interacciones débiles entre enzima y sustrato son óptimas en el estado de transición 57

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La energía de fijación entre enzima y sustrato proporciona especificidad de reacción y catálisis 59

Grupos catalíticos específicos contribuyen a la catálisis 60

Enzimas A. Propiedades generales de las enzimas B. Principios fundamentales de su acción catalítica C. Introducción a la cinética enzimática D. Enzimas reguladores 61

El modelo de Michaelis-Menten (1913) Leonor Michaelis Maud Menten Postularon que la enzima se combina en primer lugar con el sustrato, de forma reversible El complejo se descompone en una reacción más lenta, dando lugar al producto y enzima libre 62

Cinética del estado estacionario 63

Cinética del estado estacionario 64

Cinética del estado estacionario E + S ↔ ES → E + P k1 k-1 k2 d[ES] = k1 [E][S] dt - d[ES] = k-1 [ES] + k2[ES]

E + S ↔ ES → E + P Formación de ES: k1[EL][S] Descomposición de ES: k-1 [ES] + k2 [ES] k1[EL][S] = k-1 [ES] + k2 [ES] k-1+ k2 = [EL][S] k1 [ES] ET = EL + ES EL = ET - ES 66

Constante de Michaelis: k-1+ k2 = [ET - ES][S] k1 [ES] KM = Constante de disociación del complejo ES: k-1 = [EL][S] Ks = k1 [ES]

Relación entre concentración de sustrato y velocidad de reacción enzimática La velocidad inicial de la reacción siempre corresponde a la ecuación: vo = k2 [ES] Cuando toda la enzima se encuentra formando complejo ES: vmax = k2 [ET]

k1[EL][S] = k-1 [ES] + k2 [ES] Relación entre concentración de sustrato y velocidad de reacción enzimática k1[EL][S] = k-1 [ES] + k2 [ES] k1[ET - ES][S] = k-1 [ES] + k2 [ES] k1[ET][S] – k1[ES][S] = k-1 [ES] + k2 [ES] k1[ET] [S] = k-1 [ES] + k2 [ES] + k1[ES][S] k1[ET] [S] = [ES] (k-1 + k2 + k1[S]) Dividimos por k1: [ET] [S] = [ES] ((k-1 + k2 ) + [S]) k1 69

como vo = k2 [ES] vmax [S] vo = KM + [S] [ET] [S] = [ES] (KM +[S]) y [ET] vmax k2 = como vo = k2 [ES] vo = vmax [S] KM + [S] Ecuación de Michaelis-Menten

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La concentración de sustrato afecta la velocidad de reacción catalizada por enzimas

Km y Vmax son característicos para cada pareja enzima-sustrato 73

Gráfico de dobles recíprocos 1 KM 1 1 vo Vmax [S] Vmax = + y= ax + b Ecuación de Lineweaver -Burk

Si k2 es la constante del paso limitante de reacción entonces: k2 = kcat o Número de recambio El Nº de recambio es el número de moléculas de sustrato convertidas en producto por una molécula de enzima, cuando la enzima está saturada. 1/kcat es el tiempo que dura un ciclo catalítico. 75

Muchas enzimas catalizan reacciones con dos o más sustratos 76

Inhibición competitiva KM aparente es mayor que KM real Vmáx no se modifica 77

Inhibición no-competitiva 78

Inhibición acompetitiva 79

Efecto del pH sobre la actividad enzimática 80

Enzimas A. Propiedades generales de las enzimas B. Principios fundamentales de su acción catalítica C. Introducción a la cinética enzimática D. Enzimas reguladoras 81

Enzimas reguladoras Enzimas alostéricas Son reguladas por unión no-covalente de moduladores Constituyen excepciones a muchas reglas generales efecto homotrópico (positivo o negativo) efecto heterotrópico (positivo o negativo) Hay dos modelos que explican el comportamiento cinético de las enzimas alostéricas modelo simétrico (Monod) Modelo secuencial (Koshland) 82

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Enzimas reguladoras Modulación covalente reversible Fosforilación Adenililación Uridililación ADP-ribosilación Metilación 84

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Fosforilación / defosforilación 86

Activación de zimógenos 87