RESULTADOS Y DISCUCIÓN DIAGNOSTICO DE LA INFECCIÓN POR Babesia caballi y Babesia equi EN CABALLOS POR LOS MÉTODOS DE ELISA Y PCR TIEMPO REAL EN TORREÓN, COAHUILA. Hernández R M, Rodríguez H R, Cano R P ³, Reyes C J ², Rodríguez M R ¹, Yong W S1. Universidad Autonoma Agraria Antonio Narro. ³ Departamento de Horticultura; ² Departamento de Biología; 1Departamento de Ciencias Medico Veterinarias; Carretera Sta Fe y periférico Raúl Lopez Sánchez, Torreón, Coahuila. Sergio.yong@uaaan.mx INTRODUCCION La piroplasmosis equina o Babesiosis (PE) es una enfermedad de los caballos, las mulas, los asnos y las cebras, producida por protozoos y transmitida por garrapatas bajo ciertas condiciones (APHIS, 2008) y/o por la transferencia mecánica de algunos profesionales y/o empíricos con objetos punzocortantes, jeringas, agujas, o instrumental quirúrgico (APHIS, 2010). Los agentes etiológicos son parásitos de la sangre llamados Babesia equi y Babesia caballi, estos parásitos se localizan dentro de los eritrocitos de los animales infectados y están presentes principalmente en áreas tropicales y subtropicales de África (Salim et al., 2010), sur de Europa, Asia, países de la Unión de Estados Independientes, Cuba, Sudamérica y América Central (Jaffer et al., 2010), y ciertas partes del sur de los Estados Unidos de América. De los cuales B. equi es considerada mas patogénica y la causa más consistente de hemoglobinuria y muerte en equinos, aunque B. caballi causa más el síndrome persistente caracterizado por fiebre y anemia (Salim et al., 2008; APHIS, 2010). El control de la PE se está haciendo cada vez mas importante para mantener el mercado abierto a la industria equina (Camacho et al., 2005; Salim et al., 2010). De acuerdo con la OIE (2010), 35 países han reportado casos de PE entre 2005-2010, donde México es considerado como un país con enfermedad sospechosa pero no confirmada. Las enfermedades transmisibles son consideradas de importancia social y económica por ser generadores de problemas de salud pública y por estar dentro de la significancia de los tratados internacionales de animales, así como de subproductos animales. La diferenciación entre las infecciones entre B. equi y B.caballi en base a los signos clínicos no es posible de aquí la necesidad de utilizar técnicas de laboratorios a la vanguardia como lo son la prueba serológica llamada Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas competitivas ELISA (competitive Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) y la prueba reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (tiempo real) (quantitative polymerase chain reaction qPCR ó TaqMan PCR) utilizadas por Jaffer et al., (2010) . En la actualidad no existe un estudio previo de la infección de PE en el municipio de Torreón, considerando la ocurrencia de Babesia equi y Babesia caballi en caballos en áreas subtropicales (Karatepe et al., 2009; APHIS, 2010). Por lo que el objetivo de esta investigación fue determinar la presencia de la infección de PE por los métodos de ELISA y PCR tiempo real en la población equina, en un muestreo de 100 caballos con bajo rendimiento en su función zootécnica ya sea de trabajo, deportiva o placer, tomados con diferentes productores en esta área de México. RESULTADOS Y DISCUCIÓN Aunque 21 especies de garrapatas del suborden ixodoidea del género Boophilus, Dermacentor, Hyalomma y Rhipicephalus son listados como vectores de la PE (Alhassan et al., 2007; Karatepe et al., 2009; Bhoora et al., 2010). Estos géneros están presentes en esta entidad (CONASA, 2007) . Cuatro de estas son capaz de transmitir el protozoario B. equi, ocho son vectores para trasmitir B. caballi y nueve para ambas especies (APHIS, 2008; OIE, 2008; APHIS, 2010). El género encontrado y que puede ser portador, fue Rhipicefalus sanguineus con un bajo porcentaje en comparación con el género Otobius. Tabla 1 Caballos infestados por garrapatas y su función zootécnica. Grafica 1 Porcentaje de géneros encontrados. Para la prueba de ELISA de 100 muestras colectadas se encontraron 2 seropositivos a Babesia equi y ninguno para Babesia caballi. Grafica 2 Porcentajes a Babesia equi. Grafica 3 Porcentaje a Babesia caballi. Para la prueba de qPCR se enviaron las muestras de los caballos seropositivos al laboratorio de Medicina y Epidemiología de la Universidad de Davis en California, EUA (Real-time PCR Research & Diagnostics Core Facility, Department of Medicine & Epidemiology, School of Veterinary Medicine, University of Davis), donde se constato la presencia del hemoparasito Babesia equi. La industria caballar equina mexicana actualmente tiene un valor de cientos de millones de dólares y se encuentra prácticamente abandonada al garete por SAGARPA – SENASICA Sanidad Equina por lo que es necesario realizar este tipo de estudios para localizar los focos de incidencia de esta enfermedad con las técnicas mas relevantes y actuales. La introducción de los animales portadores en áreas con prevalencia de garrapatas vectoras puede conducir a una distribución epizoótica de la enfermedad (OIE, 2008). Fig. 1 Búsqueda de vector en campo. Fig. 2 Identificación taxonómica del vector. MATERIALES Y METODOS El Municipio de Torreón se localiza en la parte oeste del sur del estado de Coahuila, en las coordenadas 103º26´33” longitud oeste 25º32´40” latitud norte, a una altura de 1,120 metros sobre el nivel del mar y con un clima subtropical. Limita al norte con el municipio de Matamoros; al sur y al oeste con el estado de Durango y al este con el municipio de Matamoros. Para el examen serológico se colectaran 100 muestras de suero equino de caballos con bajo rendimiento en su función zootécnica en el área suburbana de la ciudad de Torreón, Coahuila. Toda las muestras sanguíneas serán tomadas por punción venosa en la vena yugular usando tubos y agujas vacutainer, y tanto el suero como el plasma serán separados y almacenados a -20ºC hasta su uso posterior (Salim et al., 2008). Identificación del vector. Para Identificación del vector se colectaron 60 muestras de garrapatas en 150 equinos con diferente función zootécnica en la cd. de Torreón, Coahuila. 1.- Líquido conservador: Las garrapatas pueden matarse colocándolas en alcohol al 70 % para que mueran en extensión y conservarlos en ese mismo líquido. Varios autores recomiendan matar las garrapatas en una mezcla de 97 partes de alcohol al 20 % y tres partes de éter sulfúrico, en esta mezcla mueren estiradas. 2.- Papel Secante: Para quitar de la muestra el exceso del conservador. 3.- Papel de color blanco, de preferencia para utilizarlo como contraste (Rodríguez., et al., 2005). 4.- Tubos de ensaye: Para colectar los vectores, como muestras. 5.- Pinzas: Nos ayudan a manejar las garrapatas para realizar su identificación. 6.-Estereoscopio: Para identificación taxonómica de las garrapatas. Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas competitivas. El ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas competitivas (ELISA) para la detección de anticuerpos de B. equi y B. caballi se llevo a cabo usando el equipo comercial disponible distribuido por VMRD, Inc. Siguiendo el protocolo del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (del ingles USDA United State Department of Agricultura) con los códigos 501B.20 y 501A.20, respectivamente (APHIS, 2010). Extracción de ADN para PCR. Dos de las muestras sanguíneas, de las 100 obtenidas y que fueron colectadas con ácido etilendiaminotetracetico (EDTA), fueron enviadas al laboratorio de la Universidad de Davis en California EUA por haber resultado seropositivas a la prueba de ELISA para su confirmación de la presencia del ADN hemoparasito. Preparación para automatización de extracción de Ácido Nucleico de las muestras. Se utilizaron 200 μl de sangre total en el sistema de extracción del acido nucleico (CAS-1820 X-Tractor Gene, Corbett Life Science) de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes. El resto de la sangre total fue almacenada para su respaldo a -20°C. Análisis PCR tiempo real (TaqMan) Ambas muestras fueron analizadas por la presencia del gen 18s en el orden para determinar la eficiencia de la extracción del ácido nucleico. Para la prueba de PCR tiempo real fueron usados para Babesia caballi (EU642512.1, FJ209026.1, EU888901.1) y Babesia equi (EU642507, EU642508, EU888906, EU642511, EU8889905) y fueron usados primarios Express 3 ABI por the Real-time PCR Research and Diagnostic Core Facility. Los sistemas fueron diseñados en región homologa para B. Caballi y B. Equi utilizando el acceso al banco genético que se describieron arriba. Las muestras fueron colocadas en platos y amplificados en un fluorometro amplificador (ABI PRISM 7900 HTA FAST, ABI). Las condiciones del estándar de amplificación que fueron usadas de acuerdo a ABI´s: 2 min a 50°C, 10 min a 95°C, 40 ciclos de 15 s a 95°C y 60 s a 60°C. CONCLUSIONES Dentro de la medicina veterinaria, el uso del examen de laboratorio tiene como finalidad confirmar la presencia o ausencia de enfermedades, delimitar la extensión general o local de un proceso, establecer la o las causas de una alteración, servir de guía en el pronóstico de casos clínicos y hacer el seguimiento durante el tratamiento de animales enfermos. La industria caballar equina mexicana actualmente tiene un valor de cientos de millones de dólares y se encuentra prácticamente abandonada al garete por SAGARPA – SENASICA Sanidad Equina por lo que es necesario realizar este tipo de estudios para localizar los focos de incidencia de esta enfermedad. La introducción de los animales portadores en áreas con prevalencia de garrapatas vectoras puede conducir a una distribución epizoótica de la enfermedad (OIE, 2008). De aquí la importancia de que existe caballada importada de otros países que no han pasado por un control real de esta enfermedad. Es necesario en estudios posteriores incluir el área de la comarca lagunera y no solo el municipio de Torreón sino también los demás municipios que lo comprenden tanto del estado de Coahuila como el estado de Durango. Así como su tratamiento ya que para algunos autores no existe fármaco especifico contra la PE por lo que los casos crónicos presentan signos clínicos inespecíficos como inapetencia ligera, cambio de comportamiento y un descenso de la masa corporal además de tener en claro que B. equi residirá en el caballo infectado por años y probablemente de por vida (APHIS, 2010; Salim et al., 2010). Se recomienda a los productores evitar la contaminación mecánica con el uso de jeringas y objetos punzocortantes. BIBLIOGRAFIA Alhassan, A., et al. (2007). 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