Organismos Transgénicos Generalidades y Perspectivas Biólogo – Jeremías E. Yanes Ministerio de Medio Ambiente y Recursos Naturales Dirección General de Patrimonio Natural Gerencia de Vida Silvestre, Septiembre 2008

Teorema de Malthus (Principio de las poblaciones, 1798)

Mejoramiento Genético Tradicional

ORGANISMO TRANSGÉNICO Definición: Organismo en el que se ha introducido información genética foránea precisa y definida en forma deliberada y dirigida a un dado fenotipo, de manera que esta no habría podido adquirirse mediante una transferencia genética natural.

ANTECEDENTES… 1856 – Gregorio Mendel inicia sus pruebas. 1950 – Se regeneró la primera planta por cultivo in vitro. 1953 – Watson y Crick dan a conocer el modelo atómico de ADN. 1970 – La revolución verde introduce semillas híbridas en los países del tercer mundo. 1973 – Se aisla el primer gen. 1982 – Aparece la primera aplicación comercial de la Ingeniería Genética: LA INSULINA. 1983 – Se construye la primera planta transgénica.

Continuación… 1985 – Las primeras plantas transgénicas resistentes a virus e insectos son probadas en campo. 1990 – Se lleva a cabo en campo el primer ensayo de plantas Bt resistentes a insectos. Aparece la primera patente. 1994 – El tomate FlavorSavor es aprobado por la FDA. 1995 – La FDA aprueba la soya “Roundup” y el maíz “Yield Card” 1997 – Se comercializa por primera vez en Estados Unidos de Norte América el algodón resistente a herbicidas. 1998 – DEKLAB comercializa el primer maíz resistente al herbicida “Roundup”. 2000 – Se completa el primer genoma de plantas con flores de Arabidopsis thaliana.

Distribución por categorías de los genes de Arabidopsis

El rol de la genética en la agricultura Genómica y Biotecnología 8000 Híbridos de un solo cruce 7000 6000 Híbridos de doble cruce 5000 4000 kg/ha 3000 2000 1000 1910 1920 1930 1940 1950 1960 1970 1980 1990

DOGMA CENTRAL DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR El esquema de este “dogma” ha sido encontrado repetidamente y se considera una regla general (salvo en los retrovirus). Proteína

Digestión de ambas moléculas con la misma enzima de restricción, BamHI Tecnología del ADN Recombinante Molécula A Molécula B Digestión de ambas moléculas con la misma enzima de restricción, BamHI Mezclar Tratar con ADN-Ligasa ADN recombinante Extremos cohesivos

Tomado de: www.agronort.com La información genética en los cromosomas consiste en cadenas extremadamente largas de ADN. Los genes son segmentos discretos de ADN, codificando para información especifica. En las células de cada tejido (raíz, hoja, semillas), solo ciertos genes "están prendidos", o sea que su función se expresa. La expresión de un gen es controlada por secciones vecinas del ADN. Tomado de: www.agronort.com

Tomado de: www.agronort.com Pasos para Transformar Genéticamente 1. Identificar un carácter deseable, pero que no pueda ser manejado por los métodos clásicos de mejoramiento. 2. Encontrar algún organismo que lo exprese. 3. Encontrar el gen responsable del carácter deseado, en dicho organismo. 4. Combinar dicho gen con otros elementos necesarios para que este sea funcional en la planta. 5. Mover los genes a las células de la planta. Encontrar la células MODIFICADAS EXITOSAMENTE, y regenerarlas en plantas completamente funcionales. Tomado de: www.agronort.com

Tomado de: www.agronort.com Búsqueda de fuentes para genes deseados 1. La bacteria de suelo, Bacillus thuringiensis (Bt), tiene genes para diversas proteínas, selectivamente toxicas para ciertos insectos. 2. El actinomycete de suelo, Streptomyces tiene un gen para una enzima que desdobla la molécula del Glufosinato de Amonio (herbicida). 3. Una línea mutante de Arabidopsis thaliana, tiene un gen para una versión de la enzima EPSPS, menos sensible al Glifosato. 4. Sistemas de transferencia de ADN basados en vectores biológicos Agrobacterium tumefaciens y Agrobacterium rhizogenes. Tomado de: www.agronort.com

Tomado de: www.agronort.com Mecanismo de Funcionamiento de Agrobacterium Bacteria ADN Plasmídico ADN Cromosómico Biología de Agrobacterium tumefaciens Esta bacteria, presente en el suelo, es patógena de muchas plantas a las que produce un tumor conocido como "agalla de cuello". Penetra en los tejidos vegetales causando una proliferación celular. Durante el contacto con las células vegetales la bacteria transfiere a las células vegetales un plásmido llamado Ti (Inductor de tumores). Este plásmido se integra en el ADN del cromosoma de la célula vegetal. Este plásmido transferido o T-ADN contiene los genes oncogénicos (onc) cuya expresión provoca una mayor producción de hormonas de crecimiento, éstas son las que inducen las divisiones celulares que dan origen a la formación del tumor o agalla. Tomado de: www.agronort.com

Tomado de: www.agronort.com Opciones de Transformación Indirecta: Agrobacterium 1. El patógeno de suelo Agrobacterium tumefaciens, naturalmente inserta su ADN (plásmido Ti), en las células expuestas de sus huéspedes, en tejidos radiculares dañados. 2. En otra bacteria, se ubica el gen deseable, entre las dos secuencias de borde del plásmido Ti. 3. Se integra el inserto que contiene el gen deseable, dentro del plásmido Ti, al ser incorporado nuevamente dentro del Agrobacterium. 4. Bacteria clonada, lista para transformar. Tomado de: www.agronort.com

Tomado de: www.agronort.com Clonado Los plásmidos son fáciles de manejar en tubos de ensayo, para "cortar y pegar" nuevas piezas de ADN. Los plásmidos modificados, pueden ser colocados de nuevo en la bacteria, y serán copiados en cada duplicación celular. De esta forma es posible obtener un gran número de copias del gen, tan solo incrementando la bacteria. Tomado de: www.agronort.com

Tomado de: www.agronort.com Capturando el gen Los fragmentos se mezclan con los plásmidos cortados con la misma enzima. 2 Se extrae el ADN de muchas células y se corta en pequeños fragmentos. 1 Los plásmidos colocados de nuevo en bacterias, son ahora distintos, y entonces pueden ser separados. 3 Ahora cada pieza de ADN puede cortarse cuantas veces sea necesario. Tomado de: www.agronort.com

Tomado de: www.agronort.com Encontrando el gen correcto Los plásmidos usados en la bacteria (vectores clonados), también contienen un gen de resistencia a antibióticos, de manera que solo aquellas que tengan el nuevo plásmido recombinante, crecerán en el medio de cultivo. Este gen se llama "marcador selectivo". Cada clon (progenie de bacterias con la nueva secuencia de ADN), puede ser probada para saber si contiene el gen deseado. Hay diversas maneras, dependiendo del carácter en cuestión. Tomado de: www.agronort.com

Tomado de: www.agronort.com Lo que acompaña al gen El proceso de construcción Los genes deben "estar prendidos" para expresarse; para eso se usa el promotor. El ARNm debe ser modificado para salir del núcleo, con los terminadores. Es necesario saber cuales (poco frecuentes) células han sido modificadas; para eso se agrega un gen  marcador selectivo. La combinación terminada del GEN + PROMOTOR + MARCADOR SELECTIVO + TERMINADORES, se llama CONSTRUCCIÓN O INSERTO. Promotor Gen principal Terminador Promotor Marcador Selectivo Terminador Tomado de: www.agronort.com

Plásmido listo para ser transferido a una planta Promotor Gen principal Terminador Promotor Marcador Selectivo Terminador Plásmido listo para ser transferido a una planta Tomado de: www.agronort.com & IDEA, Venezuela, 2005.

Tomado de: www.agronort.com Inserto listo para ser transferido a una planta Tomado de: www.agronort.com

Tomado de: www.agronort.com Promotores: dónde se "prenderá" el gen? 2. Algunos promotores activan el gen en casi todas las células de la planta (Pr. Constitutivos). 1. Para que el ADN transcriba el gen en ARNm, debe haber un promotor delante de la secuencia. 3. Algunos solo lo hacen en las partes verdes. 4. Otros promotores solo trabajan en tejidos específicos, como polen, raíz o tejidos dañados. Tomado de: www.agronort.com

Tomado de: www.agronort.com Marcadores Selectivos 1. El tipo mas común es el de un gen que codifica para una enzima, que desdobla algún antibiótico o componente del herbicida. 2. El gen marcador también necesita un promotor y un terminador. Nptll ----------------- Kanamicina Bar ----------------- Glufosinato de Amonio 3. Normalmente la planta moriría ante el químico. Solamente sobrevivirá si ha sido exitosamente modificada para poseer esta enzima. Tomado de: www.agronort.com

Dinámica de Agrobacterium : Uso de una bacteria como "Ingeniero Genético Natural". La bacteria conteniendo el inserto, infecta las células de la planta produciendo la recombinación genética.

Gen de la luciferasa Luciferina

Opciones de Transformación Directa: Electroporación Electroporación: Uso de carga eléctrica para que el ADN atraviese la membrana nuclear. La corriente, fuerza el paso de los insertos al interior del núcleo.

Tomado de: www.agronort.com Opciones de Transformación Directa: Gene Gun ACELERADOR DE PARTÍCULAS (Gen Gun). Un cañón artificial bombardea micropartículas con el inserto, sobre la célula. Helio Gene Gun (BioRad) Tomado de: www.agronort.com

Bombardeo de Genes  = Microproyectiles Oro - Tungsteno  = Microproyectiles 1. Incorporar el inserto en un plásmido y hacer un gran numero de copias en una bacteria. 2. Extraer los plásmidos y cubrir con ellos pequeñas partículas de oro o tungsteno (1 micrón). Bombardeo de Genes 3. Disparar las partículas mediante una explosión, sobre los tejidos. 4. Exponer las células al agente selectivo para regenerar aquellas exitosamente transformadas. Tomado de: www.agronort.com

Tomado de: www.agronort.com Los primeros desafíos: Tolerancia a Glifosato Objetivo: Transformar plantas sensibles en altamente tolerantes, para su aplicación directa. Origen: El Glifosato inhibe una enzima vegetal (EPSPS), necesaria para el crecimiento celular.

Tomado de: www.agronort.com 1er Intento Adicionar una nueva copia del gen para EPSPS, de petunia, con un promotor fuerte, para aumentar la concentración de EPSPS en la planta, y lograr tolerar mayores dosis de Glifosato. Resultado 1: Aun con mas EPSPS, las plantas fueron todavía muy sensibles, como para ser de interés comercial. Tomado de: www.agronort.com

2do Intento Resultado2: En soya, ambos mecanismos sumados funcionan adecuadamente, no así en maíz, que requiere trabajo adicional. Objetivo: Generar mutantes de algún organismo fácil de cultivar, hasta hallar algún individuo tolerante a Glifosato. Intento 2: Un aislamiento de Agrobacterium resulta menos sensible, pero su EPSPS es aun funcional; se la transfiere a plantas TG. Objetivo: Encontrar un microorganismo que produzca una enzima capaz de detoxificar la molécula de Glifosato (GOX de Achromobacter sp.). 3er Intento Resultado 3: Este intento, involucrando ambos genes resulto efectivo, logrando que las plantas estén protegidas por producir EPSPS insensible al herbicida, mas la capacidad de detoxificar parte del mismo. Intento 3: Juntar los efectos del gen para esta enzima con el gen mutante de EPSPS, en plantas de maíz. Tomado de: www.agronort.com

Tomado de: www.agronort.com EVENTO: Lograr que la planta produzca su propio insecticida. Intento 1: Poner el gen completo para la toxina-proteína en la planta, con un fuerte promotor que funcione en todos los tejidos. Origen: Algunos insectos pueden ser controlados mediante la aplicación de Deltaendotoxinas de Bacillus thuringiensis. Estas toxinas son altamente selectivas e inocuas para el hombre y el ambiente, pero se desdoblan rápidamente cuando están expuestas a la luz ultravioleta. Resultado 1: Aun con una transformación exitosa, la planta no producía suficiente proteína para protegerse a si misma. Tecnología Bt Intento 2: Insertar un gen truncado que solo codifique para la porción de la proteína correspondiente a la toxina activa. Resultado 2: La planta produce mucho mas toxina ahora, pero sería conveniente que produjera aun mas. Origen: Cuando la toxina natural (potoxina) entra en el intestino del insecto, se desdobla en la toxina activa, de cadena mas corta, por acción de las enzimas del insecto. Tomado de: www.agronort.com

Original TTAGCACCCTAGGCTAGCGTA Modificada TTACCACCCTACGCTAGCCTA Origen: La planta "prefiere" usar ciertos codones para algunos aminoácidos. Cuando no tiene estos codones "preferidos" produce mucha menos proteína. Muchos de los codones en un gen bacterial, no son los "preferidos", por lo tanto el gen no se expresa bien en la planta. Intento 3: Realizar cambios en el ADN del gen, base por base, de manera que codifique para los mismos aminoácidos, pero usando los codones "preferidos". Resultado 3: Cuando el gen es DELIBERADAMENTE INDUCIDO y además tiene los codones "preferidos", expresa suficiente toxina para su autoprotección. Original TTAGCACCCTAGGCTAGCGTA Modificada TTACCACCCTACGCTAGCCTA Tomado de: www.agronort.com

Algunos genes de interés: GEN UTILIZADO EN TRANSGÉNESIS CARACTER QUE CONFIERE Toxina de Bacillus thuringensis Resistencia a insectos Proteína de cubierta de virus Resistencia a virus Quitanasas, Glucanasas de plantas y de otros organismos Resistencia a hongos Genes cuyos productos afectan la biosíntesis de aminoácidos o la fotosíntesis Resistencia a herbicidas Lizosima humana y de cerdo. Otros péptidos bacterianos Resistencia a bacterias Genes cuyos productos afectan la biosíntesis del etileno o la formación de pared celular Retraso en la maduración de frutas

Palabras del Profesor José Ignacio Cubero Catedrático de la Universidad de Córdoba “Agricultura y Mejora Genética existen desde el mismo instante, pues la selección automática las creó simultáneamente. La agricultura sólo es posible con organismos modificados genéticamente, pues basta con seguir el ciclo indicado PARA QUE LA PLANTA SE MODIFIQUE GENÉTICAMENTE, es la Mejora Genética la encargada de obtenerlos desde su misma fundación”.

“Lo que la gente cree acerca de un sistema no es ajeno a este, sino que forma parte de el…esas creencias, cualquiera que sea la manera en que se forman, determinan efectivamente, los límites y las posibilidades de evolución del sistema, determinan lo que una sociedad puede aceptar y lo que va a exigir” Ingo Potrykus.

MUCHAS GRACIAS POR SU ATENCIÓN Biólogo – Jeremías E. Yanes Jeremiasyanes@marn.gob.sv Ministerio de Medio Ambiente y Recursos Naturales Dirección General de Patrimonio Natural