Marta Llovera Tomas Grupo de Señalización Celular y Apoptosis Departamento Ciencias Médicas Básicas Universitat de Lleida- IRBLleida

Curriculum vitae Formación académica Titulación Centro Año Licenciada en Ciencias Biológicas Universitat de Barcelona 1990 Licenciada en Grado Universitat de Barcelona 1992 Doctora en Ciencias Biológicas Universitat de Barcelona 1996 Título: Efectes del factor necròtic tumoral- en el recanvi protèic a la rata Director: Josep M. Argilés Huguet Calificación: Excelente Departamento: Bioquímica y Biología Molecular Universidad: Universitat de Barcelona Tesina de Licenciatura Soy licenciada en ciencias biológicas por la Universsidad de Barcelona. Durante el último curso de la carrera fui alumna interna del departamento de BQ y BioMol y ayudé en la preparación de las prácticas de Bioquímica. Al finalizar mis estudios busqué laboratorio para realizar la tesis, y el Dr. Josep M Argilés me ofreció la oportunidad de trabajar con él. En Diciembre de 1992 presenté mi trabajo de tesina sobre los efectos del TNF-alfa en el recambio proteico en rata y en Mayo de 1996 defensé mi trabajo de tesis sobre el papel del TNF-alfa en situacione spatológicas de pérdida de masa muscular, obteninedo la calificación de apto cum laude por unanimidad. Título: Paper del factor necròtic tumoral- en situacions patològiques associades a pèrdua de massa muscular Director: Josep M. Argilés Huguet Calificación: Apto “cum laude” por unanimidad Departamento: Bioquímica y Biología Molecular Universidad: Universitat de Barcelona Tesis Doctoral

Curriculum vitae Etapas Período Laboratorio Predoctoral 1990-96 Dept BQ i Bio Mol, UB Postdoctoral-1 1997-98 VBRC, King’s College London Postdoctoral-2 1999-2000 INSERM U344, Paris Postdoctoral-3 2001-actualidad CMB, Universitat de Lleida Después de la tesis realizé dos estancias postdoctorales en el extranjero, la primera en el VBRC del King’s College y la segunda en la unidad344 del Inserm, Dac de medicina Necker en Paris. Después obtuve una beca de reincorporación de la Generalitat que me permitió incorporarme al grupo de Joan Comella de la Universitat de Lleida, donde estoy ahora trabajando. Voy a presentarles un resumen de lo que he hecho en investigación y en docencia hasta hoy en día.

Período 1990-96 Dep. Bioquímica i Bio. Mol. Universitat de Barcelona Financiación 1991-1994 Beca para la Formación de Investigadores, DGR-Generalitat de Catalunya. 1991 Ayuda a Proyectos de Iniciación a la Investigación, CIRIT-Generalitat 1995 Beca de Colaboración Docente de la Universitat de Barcelona 1996 Beca para la investigación de “Fundació August Pi i Sunyer” Titulación Ciclo Asignatura Créditos Teor./Prac. Biologia 1 Bioquímica 6 0/6 Biologia 2 Regulació del Metabolisme Biologia 2 Ampliació de Bioquímica 24 0/24 Biologia 2 Bioquímica de la Nutrició Actividad docente Curso 1992-93 Institución: Universitat de Barcelona Curso 1993-94 Institución: Universitat de Barcelona Curso 1994-95 Institución: Universitat de Barcelona La tesis doctoral la pude realizar gracias a las becas que me concedieron, Fui becaria de la generalitatd de cat. Y obtuve también una ayuda CIRIT el primer año. Después en el 95 obtuve una beca de colaboración docente y en el 96 una beca de la Fundació August Pi i Sunyer. Durante este período, participé también de la docencia del departamento, durante dos cursos realicé prácticas de la asignatura de BQ de 1er ciclo, 6 créditos por año, y en el curso 94-95 con mi beca de colaboración docente realicé 24 créditos prácticos repartidos entre las asignaturas de Regulació del Metabolisme, Ampliació de BQ y BQ de la nutrició.

Período 1990-96 Dep. Bioquímica i Bio. Mol. Universitat de Barcelona Participación en Proyectos: Papel del factor necrótico tumoral (TNF) sobre el metabolismo lipídico del tejido adiposo: modo de acción celular. DGICYT -PB90/0497 1992-1994. IP:Dr J.M. Argilés Huguet Mecanismos moleculares implicados en el proceso de caquexia asociado a un tumor de colon. Marató de TV3 - Fundació August Pí i Sunyer (E00667) 1995-1997. IP Dr. J.M Argilés Huguet Mecanismos implicados en el proceso de caquexia asociado al crecimiento tumoral y al síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA). CICYT-PB94/0938, 1995-1997. IP: Dr. J.M. Argilés Huguet Llovera M, Garcia-Martinez C, Agell N, Lopez-Soriano FJ, Argiles JM. Muscle wasting associated with cancer cachexia is linked to an important activation of the ATP-dependent ubiquitin-mediated proteolysis. Int J Cancer 61(1):138-41, 1995. Llovera M, Garcia-Martinez C, Agell N, Marzabal M, Lopez-Soriano FJ, Argiles JM. Ubiquitin gene expression is increased in skeletal muscle of tumour-bearing rats. FEBS Lett 338(3):311-8, 1994. Costelli P, Llovera M, Carbo N, Garcia-Martinez C, Lopez-Soriano FJ, Argiles JM. Interleukin-1 receptor antagonist (IL-1ra) is unable to reverse cachexia in rats bearing an ascites hepatoma (Yoshida AH-130). Cancer Lett. 95(1-2):33-8, 1995. Llovera M, Garcia-Martinez C, Costelli P, Agell N, Carbo N, Lopez-Soriano FJ, Argiles JM. Muscle hypercatabolism during cancer cachexia is not reversed by the glucocorticoid receptor antagonist RU38486. Cancer Lett. 99(1):7-14, 1996 Publicaciones:

Período 1990-96 Dep. Bioquímica i Bio. Mol. Universitat de Barcelona Publicaciones: Llovera M, Carbo N, Garcia-Martinez C, Costelli P, Tessitore L, Baccino FM, Agell N, Bagby GJ, Lopez-Soriano FJ, Argiles JM. Anti-TNF treatment reverts increased muscle ubiquitin gene expression in tumour-bearing rats. Biochem Biophys Res Commun. 221(3):653-5, 1996 Llovera M, Garcia-Martinez C, Lopez-Soriano J, Agell N, Lopez-Soriano FJ, Garcia I, Argiles JM. Protein turnover in skeletal muscle of tumour-bearing transgenic mice overexpressing the soluble TNF receptor-1. Cancer Lett. 130(1-2):19-27, 1998 Llovera M, Garcia-Martinez C, Lopez-Soriano J, Carbo N, Agell N, Lopez-Soriano FJ, Argiles JM. Role of TNF receptor 1 in protein turnover during cancer cachexia using gene knockout mice. Mol Cell Endocrinol. 142(1-2):183-9, 1998. Garcia-Martinez C, Llovera M, Agell N, Lopez-Soriano FJ, Argiles JM. Ubiquitin gene expression in skeletal muscle is increased during sepsis: involvement of TNF-alpha but not IL-1. Biochem Biophys Res Commun. 217(3):839-44, 1995. Costelli P, Garcia-Martinez C, Llovera M, Carbo N, Lopez-Soriano FJ, Agell N, Tessitore L, Baccino FM, Argiles JM. Muscle protein waste in tumor-bearing rats is effectively antagonized by a beta 2-adrenergic agonist (clenbuterol). Role of the ATP-ubiquitin-dependent proteolytic pathway. J Clin Invest. 95(5):2367-72, 1995 Costelli P, Llovera M, Lopez-Soriano J, Carbo N, Tessitore L, Lopez-Soriano FJ, Baccino FM, Argiles JM. Lack of effect of eicosapentaenoic acid in preventing cancer cachexia and inhibiting tumor growth. Cancer Lett. 97(1):25-32, 1995

Período 1990-96 Dep. Bioquímica i Bio. Mol. Universitat de Barcelona Hipótesis El TNF induce la mobilización de la proteína muscular que tiene lugar en la caquexia cancerosa En mi proyecto de tesis queríamos estudiar si el TNF-alfa participaba en la mobilización proteica muscular que tiene lugar en las situaciones de caquexia, como en el caso de la caquexia asociada al crecimiento de un tumor. Se sabía que el crecimiento de un tumor provoca una fuerte alteración en el metabolismo del paciente. El tumor necesita un aporte constante de energía y por lo tanto provoca la mobilización de lípidos para la producción de glucosa y la mobilización de proteína muscular para la utilización de los aminoácidos como fuente de energía y para la síntesis proteica. Inicialmente se creía que los factores responsables de estas alteraciones eran factores secretados por el propio tumor al torrente sanguíneo. Después se vió que las citoquinas producidas por el huésped también podrían jugar un papel relevante y en concreto los candidatos más probables eran la IL-1 y el TNF-alfa. Tampoco se conocía cuál era el mecanismo implicado en la degradación de las proteínas musculares. proteolytic system? Tisdale MJ 2002

¿Qué sistema proteolítico está implicado en el desgaste muscular? Período 1990-96 Dep. Bioquímica i Bio. Mol. Universitat de Barcelona ¿Qué sistema proteolítico está implicado en el desgaste muscular? INTRACELLULAR PROTEOLYTIC SYSTEMS LYSOSOMAL CYTOSOLIC Cathepsins Ca2+-dep. ATP/Ub-dep. Calpains Proteasome Expresión de ubiquitina en músculo de ratas portadoras de un tumor EDL muscle proteolysis in vitro Por lo tanto nos propusimos analizar qué sistema proteolítico era el responsable del desgaste muscular que tiene lugar en la caquexia cancerosa Para ello utilizamos como modelo animal de caquexia, ratas Wistar que había sido inoculadas intraperitonelamente con células del tumor ascítico de Yoshida-AH130. Estos animales a los 7 días de crecimiento tumoral han perdido entre un 30 y un 40% de su masa muscular, como se puede observar en el gráfico de peso de los músculos EDL y gastrocnemius. Realizamos un estudio en músculos EDL aislados e incubados in vitro para determinar la proteólisi total y el grado de participación de los tres sistemas proteolíticos: el lisosomal, el dependinte de Calcio (calpainas) y el dependiente de ATP (proteasoma). La proteólisis se medía como la liberación al medio de tirosina en presencia de sustancias que inhibían los distintos sistemas. Así pues vimos que los músculos provinientes de ratas portadoras del tumor teneía una proteólisi incrementada, y que los sistemas afectados eran el Ca-dependiente pero sobretodo el ATP-dependiente. La proteólisis ATP-dependiente es la degradación de proteínas por el proteasoma, en la cual los sutratos son marcados por ubiquitinización antes de su degradación. Por lo tanto quisimos evaluar si las ratas portadoras del tumor presentaban un incremento en la expresión de los dos transcritos de ubiquitina. Vimos que la presencia del tumor provocaba un fuerte incremento en la expresión de ubiquitina y qye esta no era debida a la disminución de la ingesta, puesto que el grupo pair-fed mostraba sólo un incremento moderado en los transcritos

Tratamiento con anticuerpos anti-TNF para bloquear el TNF circulante Período 1990-96 Dep. Bioquímica i Bio. Mol. Universitat de Barcelona ¿Está el TNF implicado en la inducción de la expresión de Ubiquitina en la caquexia cancerosa? 25 mg/Kg anti-TNF s.c diariamente (6 días) Tratamiento con anticuerpos anti-TNF para bloquear el TNF circulante Efecto de la inoculación del tumor LLC en ratones KO para el receptor 1 del TNF Para demostrar la implicación del TNF-alfa en la activación de la vía proteolítica dependiente de ubiquitina que observamos en la caquexia cancerosa realizamos dos estudios. En primer lugar tratamos ratas portadoras del tumor de Yoshida con una dosis diaria de anticuerpo anti-TNF murino (25 mg/Kg s.c.) a partir del dia siguiente de la inoculación. A los siete días de crecimiento del tumor, los animales fueron sacrificados y analizamos la expresíon de ubiquitina en el múisculo esquelético. Observamos que el tratamiento con anticuerpos era capaz de bloquear el incremento de expresión de Ub y de la subunidad del proteasoma C8 asociada al crecimiento del tumor, demostrando el papel mediador del TNF-alfa en este proceso. Puesto que existian los ratones ko por el receptor-1 del TNF, nos pusimos en contacto con el grupo del Dr Lesslauer de suiza quién nos mandó los ratones. Para tarbajar con estos animales necesitábamos un modelo de tumor de ratón que indujese también caquexia en poco tiempo. Escojimos el carcinoma pulmonar de Lewis, que inoculado intramuscularmente en una extremidad posterior, produce un tumor sólido de rápido crecimiento que metastatiza a pulmón. Los animales se sacrificaban después de 15 días de la inoculación. Primero comprobamos que este tumor indujera un incremento en los niveles circulantes de TNFalfa, y como se muestar en el gràfico, tanto los animales controles como los KO mostraban un incremento en los niveles de TNF en plasma tras la inoculación del tumor. Cuando analizamos la expresión de los transcritos de ub y de la subunidad C8 del proteasoma, vimos que estos incrementaban en los animales wt portadores del tumor, pero no sucedía lo mismo en los ratones KO por el receptor de tipo 1 del TNF. Corroborando la implicación del directa del TNFalfa en la activación de esta vía de degradación, y demostrando que lo hace a través del recptor de tipo 1. El TNF es mediador de la activación del sistema proteolítico dependiente de ubiquitina en animales portadores de un tumor.

Período 1990-96 Dep. Bioquímica i Bio. Mol. Universitat de Barcelona Otras situaciones patológicas de pérdida de masa muscular: SIDA También quisimos analizar qué sucedía en otras situaciones patológicas en las que tiene lugar una importante pérdida de masa muscular. Aquí presento como ejemplo los resultados obtenidos con biopsias musculares de pacientes del virus del SIDA. En esta patología, observamos también un incremento en las expresión de ub y la subunidad del proteasoma en músculo esquelétcios en comparación con pacientes controles. Conclusiones: Implicación de la proteólisis dependiente de Ub en situaciones patológicas de pérdida de masa muscular Papel mediador del TNF- en la activación de la proteólisis muscular dependiente de ubiquitina en la caquexia cancerosa

Curriculum vitae Etapas Período Laboratorio Predoctoral 1990-96 Dept BQ i Bio Mol, UB Postdoctoral-2 1999-2000 INSERM U344, Paris Postdoctoral-3 2001-actualidad CMB, Universitat de Lleida Postdoctoral-1 1997-98 VBRC, King’s College London Una vez finalizada la tesis, realicé un estancia post-doctoral de 2 años en el Vascular biology Research center del King’s college de londres con la Dra Valentina Riveros-Moreno y Prof Jeremy Pearson.

Período 1997-98 Vascular Biology Research C. King’s College London Financiación Beca de Formación de Personal Investigador en el extranjero. Ministerio de Educación y Ciencia (1/10/1996-31/09/1998) Llovera M, Pearson JD, Moreno C, Riveros-Moreno V. (2001) Impaired response to interferon-gamma in activated macrophages due to tyrosine nitration of STAT1 by endogenous nitric oxide. Br J Pharmacol, 132(2):419-426. Publicaciones Durante este período disfruté de una beca post-doctoral del Ministerio de Educación y cultura y del trabajo realizado se derivó una publicación al British Jorunal of pharmacology

Período 1997-98 Vascular Biology Research C. King’s College London ¿Puede una elevada producción de peroxinitrito interferir en las vías de señalización activadas por IFN? CTL LPS 32 h - + - + + IFN - - - - + L-NMMA kDa 250 - 98 - 64 - 50 - 36 - 30 - Nitrite accumulated (nmoles/106 cells) Control 2  0.1 IFN 63  1.68 LPS 103  1.54 LPS + IFN 295  9.3 LPS + IFN + L-NMMA 45  2.3 Nuestra hipótesis de trabajo era que en condiciones de elevada producción de NO y en consecuencia de peroxinitrito, tiene lugar la nitración de proteínas en residuos tirosina. En consecuencia esta nitración podría interferir con las vías de señalización que van por fosforilación en tirosina. Nuestro modelo experimental era la línea celular de macrófagos murinos J774, los cuales al ser expuestos a LPS y a IFNg son activados, se induce la expresión de la sintetasa de óxido nítrico y producen grandes cantidades de NO. Este NO puede reaccionar con el radical superóxido y producir peroxinitrito, un producto muy reactivo que reacciona con las Tyr de las proteínas dando lugar a la formación de nitro-tirosina. Con anticuerpos anti nitro-tirosina comprobamos que tras la exposición de los macrófagos a LPS y IFNg durante 32 horas la nitración de proteínas celulares aumentaba considerablemente. Este incremento en la nitración se correlacionaba con el incremento de nitritos en el medio de incubación (como medida de la producción de NO). Cuando durante el tratamiento añadíamos el inhibidor de la iNOS L-NMMA, bloqueábamos el incremento en nitritos y la nitración de proteínas.

Período 1997-98 Vascular Biology Research C. King’s College London ¿Puede una elevada producción de peroxinitrito interferir en las vías de señalización activadas por IFN? Control LPS + IFN 32h IFN 15 min IFN 15 min NO2-Tyr P-STAT1 STAT1  kDa - 98 - 64 - 50 - 36 IEF SDS-PAGE El interferón gama interacciona con su receptor provocando su dimerización y la activación de las kinasas Jak1 y Jak2. Estas kinasas son las responsables de la transmissión del señal a través de la fosforilación de los factores de transcricpción STAT1, los cuales dimerizan se translocan al núcleo y activan la transcripción de los genes diana. La estimulación de los macrófagos J774 con gIFN durante 15 minutos provoca la fosforilación de STAT1, la cual puede ser detectada por WB con anticuerpos fosfoespecíficos. Si la estimulación la hacemos tras la incubación con LPS durante 16 o 32h, observamos que la respuesta de fosforilación de STAT1 es menor. Este efecto es parcialmente revertido por la inhibición de la iNOS con L-NMMA, demostrando que esta inhibición se correlaciona con la producción de NO. Para demostrar que la inhibición de la fosforilación en STAT1 era debida a la nitración directa sobre Stat1, realizamos inmunoprecipitaciones de Stat1 y resolvimos los IP por electroforesis bidimensional y western blot. Como se puede observar en estas imágenes la exposición de las células a LPS + IFN durante 32h provoca un incremento en la nitración de STAT1 y la addición de IFN durante 15 min no puede promover su fosforilación, a pesar de que la expresión de STAT1 ha incrementado. Con estos resultados se demuestra que la producción elevada y sostenida de NO provoca la inhibición de la vía de señalización del IFNg, debido a la nitración del factor de transcripción STAT1 y en consecuencia el bloqueo de su fosofrilación. P-STAT1  STAT1 La producción sostenida de NO provoca la inhibición de la vía de señalización activada por IFN , debido a la nitración en tirosina de STAT1 y el consecuente bloqueo de su fosforilación