Tema 3 Técnicas en Bioquímica Electroforesis Universidad de Carabobo Facultad de Ciencias de la Salud Escuela de Medicina“Dr. Witremundo Torrealba" Departamento de Fisiología y Bioquímica Tema 3 Técnicas en Bioquímica Electroforesis Br. Pérez José Br. Pérez Eleanny Br. Pérez Ana Marzo, 2012

Objetivos Específicos Analizar los fundamentos teóricos de la electroforesis y su utilidad.

Contenido Movimiento iónico en un campo eléctrico. Proceso electroforético. Cámara electroforética. Materiales de soporte. Utilidad de cada una de ella: Electroforesis en geles de acrilamida. Electroforesis en geles de acrilamida SDS. Electroforesis bidimensional. Electroforesis en geles de agarosa.

Electroforesis Es una técnica para la separación de moléculas según la movilidad de estas en un campo eléctrico

Desventajas Afecta la estructura de las proteínas por lo tanto, también afecta a la función de la misma.

Ventajas Separación, visualización y cuantificación del numero de proteínas de una solución.

Movimiento iónico en un campo electromagnético. Las moléculas de soluto con carga neta positiva se desplazan hacia el cátodo y las moléculas con carga neta negativa se desplazan hacia el ánodo. http://www.micruxfluidic.com/es/tecnologia.html

Movimiento iónico en un campo electromagnético. La movilidad μ expresada en cm2 por Volt-s de una molécula en un campo eléctrico, viene dada por la velocidad de emigración V expresada en cm/s, respecto de la fuerza del campo E, expresada en voltios/cm. La movilidad depende de la carga de la partícula que, a su vez, depende del pH del medio en el que se encuentre. Por esta razón es necesario indicar el electrolito o el pH utilizado para determinar la movilidad.

Proceso electroforético En la electroforesis libre una disolución tamponada de la mezcla de proteínas se coloca en una célula de observación en forma de U mayúscula, depositando una capa de tampón (buffer) puro sobre la disolución de proteínas.

Cámaras electroforéticas. Unidades Horizontales: Unidades Horizontales: Unidades Horizontales:

Tipos de electroforesis

Electroforesis de frente móvil Es aquella en la cual las partículas se mueven de forma libre en el medio en que se encuentran dispersas.

ELECTROFORESIS DE ZONA La muestra esta obligada a desplazarse sobre un soporte solido tal como el papel o ciertos geles.

¿Qué se necesita para realizar una electroforesis de zona?

FACTORES QUE EFECTAN LA ELECTROFORESIS

CARGA NETA TAMAÑO Y FORMA POTENCIAL DEL CAMPO ELÈCTRICO

MECANISMOS DE SOPORTE

NO RESTRICTIVOS PAPEL Separación de sustancia de bajo peso molecular ACETATO CELULOSA Se usa en análisis biológicos Débil resolución AGARASO Es un polisacárido Se usa para la separación de ácidos nucleicos

ELECTROFORESIS CON PAPEL ELECTROFORESIS CON AGAROSA

RESTRICTIVOS GELES DE ALMIDÒN Proviene de diversas fuentes naturales POLIACRILAMIDA El mas usado en la electroforesis Son geles completamente inertes, estables y transparentes

ELECTROFORESIS DE POLIACRILAMIDA

Electroforesis en geles de acrilamida Proteínas presentes en el extracto celular Son químicamente inertes. Son transparentes Son estables en un amplio intervalo de valores de pH, temperatura y fuerza iónica Son resistentes a los agentes desnaturalizantes. Pueden prepararse con tamaños de poro muy variados. Enzima RNA polimerasa de la bacteria E coli Lehninger Principios de Bioquímica 4ta Edición

Electroforesis en geles de acrilamida SDS Compuesto de gran carga negativa. Utilizado para estimar la pureza y la masa molecular. Se une a las proteínas en una cantidad proporcional a la masa molecular. Confiere a todas las proteínas un cociente Carga/Masa similar. Lehninger Principios de Bioquímica 4ta Edición

SDS - PAGE Separa a las proteínas casi exclusivamente en función de su masa molecular Lehninger Principios de Bioquímica 4ta Edición

Electroforesis bidimensional Es la combinación secuencial del enfoque isoeléctrico y la electroforesis en gel con SDS. SDS - PAGE Lehninger Principios de Bioquímica 4ta Edición

Electroforesis en geles de Agarosa Los geles se comportan como un tamiz molecular y permiten separar moléculas cargadas en función de su tamaño y forma.

Resumen Los procedimientos de fraccionamiento se usan para purificar las proteínas sobre la base de sus solubilidades, cargas, tamaños y especificidades de unión. La electroforesis separa las moléculas según su tamaño y su carga. La SDS-PAGE las separa principalmente por su tamaño. La electroforesis en gel con SDS y el Enfoque Isoeléctrico se pueden utilizar por separado o combinados para obtener una mayor resolución. La electroforesis bidimensional (2D) puede separar cientos de proteínas.

Bibliografía http://www.uco.es/organiza/departamentos/bioquimica-biol-GELES%20AGAROSA.pdf http://idibam.blogspot.com/2008/09/electroforesis-en-gel-de-agarosa.html Lehninger. Principios de bioquímica Cuarta Edición. Harold A .Harper .Manual de química Fisiológica Sexta Edición. Biochemistry (3rd Edition) by Christopher K. Mathews Kensal E. van Holde Kevin G. Ahern

Las grandes obras no son hechas con la fuerza, sino con la perseverancia.