INTRODUCCIÓN A LOS BIOPROCESOS Ingeniería Bioquímica I Parte II Ingeniería Bioquímica I        . Evolución y características de los bioprocesos . Introducción a las operaciones de un proceso biotecnológico . Selección de un proceso Alejandra Bosch

SELECCIÓN DE UN PROCESO BIOTECNOLÓGICO ASPECTOS QUE INTERVIEN EN LA SELECCIÓN DE UN PROCESO A) ECONÓMICO Relacionados con el mercado y especificaciones del producto Evaluar el potencial económico del producto   B) TÉCNICO Relacionados con el diseño del proceso Desarrollar y evaluar varios esquemas de operación para obtener el Diseño óptimo   DESARROLLAR UN DISEÑO COMPLETO DEL BIOPROCESO     Secuencia de operaciones de separación El equipamiento requerido

¿Cuáles podrían ser los productos de interés? insulina, antibióticos, hormonas, enzimas Procesos y servicios que emplean microorganismos cervezas, vinos, vacunas, organismos para biorremediación

Material biológico de partida Células vegetales Células animales bacterias

Proteínas Son las macromoléculas biológicas más abundantes Se encuentran en todas las células y en todas partes dentro de las células Existen miles de diferentes tipos y tamaños de proteínas Exhiben una gran cantidad de diversidad de funciones

Función biológica de las proteínas en bacterias Ejemplo Enzimas Hexoquinasas, isomerasas, hidrolasas Transporte Ingreso de nutrientes en las bacterias Contráctiles pilina (cilias y flagelos) Toxinas Venenos, diftérica Estructurales Recubrimiento viral, pared celular,

SELECCIÓN DE UN PROCESO BIOTECNOLÓGICO ASPECTOS QUE INTERVIEN EN LA SELECCIÓN DE UN PROCESO A) ECONÓMICO Relacionados con el mercado y especificaciones del producto Evaluar el potencial económico del producto   B) TÉCNICO Relacionados con el diseño del proceso Desarrollar y evaluar varios esquemas de operación para obtener el Diseño óptimo   DESARROLLAR UN DISEÑO COMPLETO DEL BIOPROCESO     Secuencia de operaciones de separación El equipamiento requerido

Especificaciones del material de partida y producto 1) ESPECIFIACIÓN DEL PRODUCTO: DEFINIR EL OBJETIVO FINAL (“Start at the end”) Definir el producto y su utilización: - producto final (cual es?, Cómo se usa?) pureza requerida rangos de concentración de impurezas permitidas alguna impureza que deba ser eliminada Tioxicidad, estabilidad, 2) CARACTERÍSTICAS DEL MATERIAL DE PARTIDA -fuente: bacteria (E. coli) fermentación cultivo de células (presencia albúmina, suero , restos de membranas- levaduras (producto intracelular o extracelular?) -Características fisicoquímicas del material de partida ( viscosidad, tamaño de partículas) y del producto final (pI, PM, estabilidad,)

SELECCIÓN DE UN PROCESO BIOTECNOLÓGICO ASPECTOS QUE INTERVIEN EN LA SELECCIÓN DE UN PROCESO A) ECONÓMICO Relacionados con el mercado y especificaciones del producto Evaluar el potencial económico del producto   B) TÉCNICO Relacionados con el diseño del proceso Desarrollar y evaluar varios esquemas de operación para obtener el Diseño óptimo   DESARROLLAR UN DISEÑO COMPLETO DEL BIOPROCESO     Secuencia de operaciones de separación El equipamiento requerido

A) ASPECTOS ECONOMICOS Una vez definido El producto La pureza deseada La concentración deseada A) ASPECTOS ECONOMICOS B) ASPECTOS TÉCNICOS DEFINIR EL PROCESO Definir las operaciones y secuencia de separación Etapas o tiempo por operación Escala Costo   PRODUCTO

PROCESO DE SÍNTESIS Y OPTIMIZACIÓN Definir las operaciones y secuencia de separación Objetivo de este paso es explotar al máximo las propiedades fisicoquímicas que diferencian al producto deseado del resto de los productos “contaminantes” de la manera más económica i) elegir entre OPERACIONES alternativas ii) diseño de una SECUENCIA ÓPTIMA para obtener máximo rendimiento con el menor número de pasos - Existen muchas alternativas y en diferente orden (es un problema de combinatoria)

¿Cuáles son las OPERACIONES alternativas? 1.- 2.- 3.- 5.-

1.- Remoción celular: Centrifugación - filtración 2. DISRUPCIÓN CELULAR Y SEPARACIÓN DE RESTOS CELULARES La técnica más recomendada para alta escala son los homogeinizadores (Gaulin homogenizer) - Homogeinización: - suspensiones celulares 15-20% (peso seco) - concentración celular no afecta la eficiencia - es necesario refrigerar (4-5ºC) - Modelos más grandes 6,000 L/h (levaduras y bacterias) Molinos de perlas pequeñas perlas de vidrio (0.3-0.4mm ) - diferentes diseños de agitadores - concentración de células afecta la eficiencia concentración óptima  30-60% peso húmedo modelos mas grandes 2000 L/h Ruptura química o enzimática limitado a baja escala (Lysozyme, Triton, otras)

Separación de restos celulares centrifugación (no adecuada) ultrafiltración (300,000 – 500,000 o mayor) Microfiltración (0.1 m.) partición en dos fases acuosas (células rotas y restos quedan en la fase inferior) CDR (cell Debris Remover: Whatman) 3. CONCENTRACIÓN Los productos deben concentrarse hasta 10-50 veces. Técnica preferida : Ultrafiltración - partición líquido-líquido. Extracción con solventes - Precipitación (sulfato de NH4) -Evaporación - Destilación

4.- PRETRATAMIETNO O EXTRACCIÓN DEL PRODUCTO Adsorción Intercambio iónico Cromoatografía de intercambio hidrofóbico 5.- PURIFICACIÓN DE ALTA RESOLUCIÓN - Cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) -Cromatografía de intercambio iónico de alta resolución - Cromatografía de afinidad - Cromatografía metal quelante (IMAC) . Otras cromatografías: dye-ligand chromatography (triazine-colorante) 6. ACABADO esterilización y estabilización del producto deshidratación, liofilizado, estabilización (sales)

PROCESO DE SÍNTESIS Y OPTIMIZACIÓN i) elegir entre OPERACIONES alternativas ii) diseño de una SECUENCIA ÓPTIMA para obtener máximo rendimiento con el menor número de pasos - Existen muchas alternativas y en diferente orden (es un probelma de combinatoria) ¿Cómo elegimos las operaciones y secuencias?

Solución rigurosa o solución algorítmica Resuelve qué operaciones son apropiadas pero NO SECUENCIA Utilización de las reglas de oro de la purificación - Método Heurístico. Resuelve las OPERACIONES y la SECUENCIA 3. Uso de TECNICAS DE INTELIGENCIA ARTIFICIAL: SISTEMAS EXPERTOS (SE) - utilizan el conocimiento empírico escanean toda la información acerca de las propiedades de la muestra y las operaciones toma en cuenta las reglas de oro de la purificación utilizan correlaciones matemáticas y bases de datos Encuentran una solución óptima al problema del proceso de purificación y la secuencia

1.- Solución rigurosa o solución algorítmica Utilización de métodos numéricos clásicos, ecuaciones de diseño. Resuelve el punto de OPERACIONES permitiendo elegir entre operaciones alternativas. Emplea técnicas de programación matemática. Crean un diagrama de flujo que contiene todas las posibles alternativas de diseño

Utilización de las reglas de oro de la purificación - Método Heurístico. Resuelve OPERECIONES Y SECUENCIAS Emplea reglas desarrolladas a través Diseños previos y experiencia exitosas de otros procesos Antecedentes del mismo proceso Sentido común

2. Utilización de las reglas de oro de la purificación REGLA 1 “Elegir procesos de separación basados en diferentes propiedades físicas, químicas o bioquímicas” REGLA 2 “Separar las impurezas más abundantes primero” Es importante eliminar el agua en las primeras etapas del proceso. Tratar de reducir el material de trabajo hasta un 90% del volumen inicial REGLA 3 “Seleccionar un procesos que permita aprovechar al máximo las diferencia entre las propiedades fisicoquímicas del producto y los contaminantes. - Se deben conocer las propiedades del producto y de las principales impurezas REGLA 4 “Realizar las separaciones más caras y difíciles al final” KEEP IT SIMPLE!

Propiedades físico - químicas Punto isoeléctrico Ejemplo REGLA 1 REGLA 1 “Elegir procesos de separación basados en diferentes propiedades físicas, químicas o bioquímicas” Propiedades de las proteínas a tener en cuenta en los proceso de separación y purificación Propiedades físico - químicas Punto isoeléctrico Carga, curva de valoración Tamaño, PM Especificidad por ligandos Propiedades de superficie (hidrofobicidad) Estabilidad

Características fisicoquímicas de las principales proteínas de E. Coli 20 40 60 80 100 120 140 160 100 M. W. ´s (x103) 90 80 70 30 60 50 40 20 10 Number of Proteins Distribución de PM Distribución de PIs 70 pI 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 60 50 40 Number of Proteins 30 20 10

Operaciones de Separación y Purificación de proteínas en gran escala Métodos de Recuperación y purificación y las correspondientes propiedades físicoquímicas involucradas en la operación [*] Operation Physico-chemical property Centrifugation Sedimentation Velocity Filtration Particle size Microfiltration Particle size Homogeneization Intracellular nature (pressure gradient) Bead milling Intracellular nature (liquid/solid shear) Ultrafiltration Mol ecular size Two phase extraction Partition coefficient Precipitation Solubility (hydrophobic interaction) Adsorption Van der Waals forces, H bonds, polarities, dipole moments Ion - exchange Charge (titration curve) Hydrophobic interaction Surface hydrop hobicity Affinity chromatography Biological affinity Gel filtration Molecular size Reversed phase liquid chromatography Hydrophilic and hydrophobic interactions [*] Prokopakis and Asenjo (1990)

SINTESIS DE UN PROCESO DE BIOSEPARACIÓN aproximación Heurística Intracelular remoción del componente más abundante 1. SEPARACIÓN CELULAR PASOS 1. Desarrollar un diagrama de bloques con las principales etapas 2. Seleccionar para cada etapa las operaciones alternativas tratando de emplear las reglas 2. DISRUPCIÓN CELULAR REMOCIÓN DE RESTOS CELULARES Y DESECHOS Extracelular 3. CONCENTRACIÓN 4. PRETRATAMIENTO Es muy importante la elección del PASO INICIAL, ya que es el que debe eliminar la mayoría de los contaminantes. Los pasos subsiguientes son empleados para eliminar los contaminantes de menor importancia 5. PURIFICACIÓN DE ALTA RESOLUCIÓN 6 ACABADO

3. Uso de TECNICAS DE INTELIGENCIA ARTIFICIAL: SISTEMAS EXPERTOS (SE) - utilizan el conocimiento empírico escanean toda la información acerca de las propiedades de la muestra y las operaciones toma en cuenta las reglas de oro de la purificación utilizan correlaciones matemáticas y bases de datos Encuentran una solución óptima al problema del proceso de operaciones y la secuencia

Base de datos. Conocimiento requerido para solucionar el problema específico. Reglas de purificación. Conocimiento empírico. Motor deductivo. Es el programa que utiliza el conocimiento para tomar decisiones. Permite la comunicación entre el conocimiento y el programa. Secuencia de operaciones en un proceso downstream y la comparación entre varios métodos de separación en términos de costos y eficiencia

Muestra la implementación de dos criterios para seleccionar la mejor secuencia de operaciones para la purificación de una mezcla simple de proteínas y otra compleja (sobrenadante de cultivo) selection separation coefficient (SSC criterion) final level of purity (Purity criterion) ???? The design of downstream processes for large-scale protein purification

ii) Escala de operación Ver la compatibilidad entre la operación y la escala en la cual se va a diseñar   Analizar el límite que poseen las operaciones elegidas iii) Número de etapas Debe considerarse en el diseño si los procedimientos seleccionados requieren de alguna etapa de regeneración, elusión del producto deseado, etc iii) Costos costos de operación Costos fijos Gastos de planta administración (impuestos) Investigación y desarrollo