II JORNADA “ACTUALIZACIÓN EN ALIMENTACIÓN Y SALUD” Murcia, octubre de 2004 LOS FLAVONOIDES DEL VINO COMO AGENTES PROTECTORES DEL SÍNDROME METABÓLICO Dr. Lluís Arola Ferrer Universidad Rovira i Virgili de Tarragona Departamento de Bioquímica y Biotecnología

EFECTO DEL CONSUMO DE BEBIDAS ALCOHÓLICAS Consumiciones por semana Riesgo relativo. Mortalidad total CONSUMO MODERADO: Hombre: máximo 40 g etanol/día Mujer: máximo 24 g etanol/día

INGESTA DE FLAVONOIDES Y MORTALIDAD CORONARIA Gráfico según Hertog et al., Arch Intern. Med., 1995

CATEQUINA, un monómero de favanol UVA (pieles y semillas) Raspón Levaduras Barricas de madera OH HO O PROCIANIDINA B1, dímero COMPUESTOS FENÓLICOS NO FLAVONOIDES FLAVONOIDES O-Glucosa OH OCH3 HO O+ Malvidina-3-glucósido ÁCIDOS FENÓLICOS: Benzoico, Cinámico ESTILBENOS: Resveratrol 20-40 mg/l OH HO O CATEQUINA, un monómero de favanol HO OH O OR Ácido gálico HO OH H Tansresveratrol FLAVONOLES: Quercetina ANTOCIANINAS FLAVANOLES Tintos ³ 1000 mg/l Blancos < 50 mg /l O H OH HO O Quercetina OLIGÓMEROS: Proantocianidinas POLÍMEROS: Taninos condensados MONÓMEROS: Catequina

COMPOSICIÓN FENÓLICA DE LOS VINOS (mg/l) 2 4 6 8 1 Flavonoles Catequinas Antocianinas Vino tinto Vino blanco Proantocianidinas Ácidos benzoicos Ácidos cinámicos

POTENTE ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE: POTENTE INTERACCIÓN CON PROTEÍNAS FLAVONOIDES POTENTE ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE: capturan especies oxigenadas reactivas, quelan metales e inhiben enzimas productoras de radicales libres O A B C FLAVONOIDE POTENTE INTERACCIÓN CON PROTEÍNAS O H

ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE LOS FLAVONOIDES INHIBIDORES DE SISTEMAS GENERADORES DE RADICALES (p. ej., xantina oxidasa) BARRENDEROS DE RADICALES LIBRES Fl(OH) + R· ----- Fl (O·) + RH QUELANTES DE IONES METALICOS Fe 2+, Cu 2+ INTERRUPTORES DE REACCIONES RADICALARIAS EN CADENA (Peroxidación lipídica) AHORRADORES DE VITAMINA E

INTERACCIÓN DE FLAVONOIDES CON PROTEÍNAS EFECTO TANATO: acción antihemolítica OTROS: disminución LDL, aumento HDL, disminución colesterol INTERACCIÓN CON ENZIMAS CREACIÓN DE CROSS-LINKS: refuerzo del colágeno INHIBICIÓN DE ENZIMAS: histidina descarboxilasa, ascorbato oxidasa, aldosa reductasa, catecol o-metil transferasa, etc BLOQUEO DE SUSTRATOS: reducción de la actividad de colagenasa, elastasa, hialuronidasa, proteasas, etc

INTERACCIÓN DE FLAVONOIDES CON PROTEÍNAS INTERACCIÓN CON RECEPTORES CELULARES INTERACCIÓN CON RECEPTORES NUCLEARES MODIFICACIÓN DE LA EXPRESIÓN GÉNICA CAMBIOS METABÓLICOS Y FISIOLÓGICOS

Los flavonoides condicionan una múltiple capacidad de interacción con proteínas y DNA y condicionan una diversidad significativa de cambios metabólicos. Los flavonoides inducen una disminución de la mortalidad por patologías cardiovasculares. HIPÓTESIS: ¿Es posible que tengan un efecto directo sobre el síndrome metabólico?

SINDROME METABÓLICO: Conjunto de diversos factores de riesgo de patologías metabólicas y cardiovasculares. SINDROME METABÓLICO: Un conjunto de múltiples factores interrelacionados que aumentan el RIESGO CARDIOVASCULAR. Parece que es el resultado de una colisión entre “thrifty genes” suceptibles y una sociedad caracterizada por una aumentada prevalencia de obesidad y un estilo de vida sedentario. El paciente típico se caracteriza por obesidad abdominal, un grado variable de intolerancia a la glucosa, dislipidemia y, a menudo, hipertensión. Los componentes del síndrome metabólico están asociados con resistencia a la insulina, alteraciones en la coagulación y la fibrinolisis, disfunción endotelial y elevación de marcadores de inflamación subclínica. Thrifty genes: genes ahorrativos

CRITERIOS DIAGNÓSTICOS DEL SÍNDROME METABÓLICO Criterios OMS-98* Criterios NCEP-ATP III Alteración del metabolismo glucidico Resistencia a la insulina y/o Intolerancia a la glucosa Diabetes mellitus Glucemia basal: 110-125 mg/dl HTA y/o TA > 140/90 mmHg IMC > 30 Kg/m2 y/o ICC > 0,90 (♂) o 0,85 (♀) Exploratorios TA > 130/85 mmHg PAbd > 102 (♂) o 88 (♀) cm cHDL < 35 mg/dl (♂) < 39 mg/dl (♀) y/o TG > 150 mgl/dl Microalbuminuria > 20 cg/min (o índice albúmina/creatinina > 20 mg/g) cHDL < 40 mg/dl (♂) < 50 mg/dl (♀) y/o TG > 150 mg/dl CRITERIOS DIAGNOSTICOS OMS-98 Y NCEP-ATP III DIFERENCIAS CONCEPTUALES ENTRE AMBOS Analíticos * EGIR comment on the provisional report of a WHO Consultation. Diabet Med 1999; 16:442-443 **Executive summary of the Third Report of the NECP. ATP III. JAMA 2001; 285:2486-2497

Isomaa, B.: Life Sciences, 73, 2395-2411, 2003

Reilly, Rader, Circulation 108, 1546-1551, 2003 Figure 1. Pathophysiology of atherosclerotic cardiovascular disease in the metabolic syndrome. Central adiposity and innate immunity play key roles in the development of insulin resistance, chronic inflammation, and metabolic syndrome features through the effects of adipokines (eg, leptin, adiponectin, resistin) and cytokines (eg, tumor necrosis factor-  , interleukin-6) on liver, skeletal muscle, and immune cells. In addition, monocyte/macrophage and adipocyte-derived factors may have direct atherothrombotic effects that promote the development of atherosclerotic cardiovascular events. Common genetic variants and environmental factors may impact the development of atherosclerosis at multiple levels through influences on central adiposity, innate immunity, glucose and lipoprotein metabolism, and vascular function. Reilly, Rader, Circulation 108, 1546-1551, 2003

Efectos de los flavonoides del vino sobre: El peso corporal ESTUDIO EXPERIMENTAL Efectos de los flavonoides del vino sobre: El peso corporal El metabolismo de los triglicéridos y el colesterol in vivo El metabolismo lípidico in vitro El metabolismo glucídico in vivo El metabolismo de la glucosa in vitro

Animales sanos (rata Zucker macho de 250g) DISEÑO EXPERIMENTAL Animales sanos (rata Zucker macho de 250g) Dieta rica en azúcares y grasa saturada Consumo voluntario y moderado de vino tinto (1-1,5 ml día) 8 semanas

PESO CORPORAL DE ANIMALES ALIMENTADOS CON DIETA HIPERLIPÍDICA

Efectos de los flavonoides del vino sobre: El peso corporal ESTUDIO EXPERIMENTAL Efectos de los flavonoides del vino sobre: El peso corporal El metabolismo de los triglicéridos y el colesterol in vivo El metabolismo lípidico in vitro El metabolismo glucídico in vivo El metabolismo de la glucosa in vitro

Animales sanos (rata Wistar macho de 250g) Situación post-prandial DISEÑO EXPERIMENTAL Animales sanos (rata Wistar macho de 250g) Situación post-prandial Administración oral (sonda intragástrica) Dosis elevada de extracto de procianidinas (250 mg EP/kg de peso) Efecto a corto plazo (5 horas)

TRIGLICÉRIDOS PLASMÁTICOS 50 100 150 200 250 control EP mg dL -1 *

DISTRIBUCIÓN DEL COLESTEROL PLASMÁTICO *

Small Heterodimer Partner (SHP) CYP7A1 Apo AII Apo C I Apo CIII EXPRESIÓN GÉNICA HÍGADO Small Heterodimer Partner (SHP) receptor nuclear, factor clave de la homeostasis lipidica a nivel transcripcional CYP7A1 colesterol 7 alfa hidroxilasa, enzima limitante en la conversión de colesterol en ácidos biliares Apo AII Apo C I Apo CIII Lipoprotein lipasa Músculo Tejido adiposo

Efectos de los flavonoides del vino sobre: El peso corporal ESTUDIO EXPERIMENTAL Efectos de los flavonoides del vino sobre: El peso corporal El metabolismo de los triglicéridos y el colesterol in vivo El metabolismo lípidico in vitro El metabolismo glucídico in vivo El metabolismo de la glucosa in vitro

METABOLISMO LIPIDICO EN ADIPOCITOS EN PRESENCIA DE FLAVONOIDES Células 3T3-L1 24 horas Medio Células Glicerol Parámetros diversos 150 mM epicatequina 150 mM catequina 150 mM extracto de procianidinas A (PM 1296) 150 mM extracto de procianidinas B (PM 1399) mRNA LSH, fa referència a la LIPASA SENSIBLE A LES HORMONES. Quantificat a través d’un northern blod i utilitzant actina com a referència (treball Anna Ardèvol)

LAS PROCIANIDINAS INDUCEN UNA ACTIVACIÓN DE LA LIPOLISIS EN ADIPOCITOS EN CULTIVO. vs control Los extractos de procianidinas provocan una aumentada lipólisis a largo plazo, tal como indican los niveles de glicerol producidos.

glycerol release vs control EL EFECTO LIPOLITICO DE LAS PROCIANIDIAS REQUIERE LA PARTICIPACIÓN DE LA PROTEÍN QUINASA A Effect of H89 on procyanidin-induced lipolysis. Fully differentiated 3T3-L1 adipocytes were treated with 100 µmol/L grape seed procyanidins extract (PE) in the presence of different concentrations of H89 for 15 hours. H89 treatment was done 10 minutes before PE addition. Data are expressed as glycerol release vs PE-induced lipolysis. Values represents mean ± SEM. The letters (a, b) indicate statistically significant differences between H89 concentrations. 1,0 1,3 1,5 1,8 2,0 5 10 15 20 25 H89 ( m mol/L) glycerol release vs control 1.0 2.0 1.5 a b La incubación simultanea con procianidinas y H89, inhibidor especifico de la PKA, reduce la lipólisis de forma dosis dependiente, lo que indica la participación directa de la PKA.

EL EFECTO LIPOLITICO DE LAS PROCIANIDIAS VIENE MEDIADO POR EL AMPc Effect of procyanidin and epinephrine on cyclic AMP levels. Differentiated 3T3-L1 adipocytes were exposed for 8 minutes to 150 µmol/L grape seed procyanidins extract (PE) or 1 µmol/L epinephrine. cAMP levels (pmols/mg protein) are normalized to the control levels (100%). Each value represents mean ± SEM. * p < 0.05 compared to control. Las prociandinas aumentan el AMPc al mismo nivel que la epinefrina.

LAS PROCIANIDIAS INTERACTÚAN CON RECEPTORES b-ADRENÉRGICOS: Compiten con la epinefrina No se produce un efecto aditivo entre procianidinas y epinefrina sobre la acción lipolítica Effect of procyanidins on epinephrine-induced lipolysis. 3T3-L1 adipocytes were incubated for 15 hours with 0-1000 nmol/L epinephrine in the absence or presence of 100 µmol/L grape seed procyanidins extract (PE). Glycerol content of the medium (µmol glycerol /mg protein) is normalized to the control values. Values represent mean ± SEM. * p < 0.05 compared to epinephrine-treated cells.

De todas las moléculas descritas hasta el momento con acción lipolítica, la molécula que presenta una cinética de acción más similar a las procianidinas es el factor de necrosis tumoral TNF-a. La acción lipolítica del TNF-a se bloquea mediante la tiazolidinediona BRL49653, un agonista de elevada afinidad del receptor activador de la proliferación de los peroxisomas PPARg. Actúan de igual forma las procianidinas?

PPARg MEDIATIZA LOS EFECTOS DE LAS PROCIANIDINAS: El agonista de elevada afinidad para PPARg, la tiazolidinediona BRL 49653, antagoniza el efecto lipolítico de las procianidinas Effect of BRL49653 on procyanidin-induced lipolysis. Fully differentiated 3T3-L1 adipocytes were treated with 100 µmol/L grape seed procyanidins extract (PE) in the presence of different concentrations of BRL 49653 for 15 hours. Data are expressed as % of PE-induced lipolysis. Values represents mean ± SEM. El BRL 49653 anula el efecto lipolítico de las procianidinas, lo que indica que está mediado por el PPARg peroxisome proliferator-activated receptor-g (PPAR-g) . The thiazolidinedione BRL49653, a high affinity PPARg agonist(16), blocks the lipolytic action of TNF-a (17). In the figure 4, ES POT VEURE, that BRL 49653 ANULA the lipolytic effect of procyanidins

LAS PROCIANIDINAS DISMINUYEN LOS NIVELES DE mRNA DE PPARg Procyanidin effects on PPARg2 mRNA levels. 3T3-L1 adipocytes were incubated for 15 hours with 100 µmol/L grape seed procyanidins extract (PE), 0.1 µmol/L BRL 49653 (BRL), and a combination of the two. After treatment, total RNA was extracted and gene expression was quantified by real-time RT-PCR. PPARg2 gene expression, normalized by GAPDH mRNA levels, is expressed relative to control cells. Values represents mean ± SEM. a, b, c indicate groups significantly different with p<0.05. La disminución de mRNA de PPARg es está también directamente relacionada con la limitación del proceso de diferenciación de la célula adiposa. También el TNF-a manifiesta este efecto desdifrenciador

LAS PROCIANIDINAS NO MODIFICAN LA CONCENTRACIÓN INTRACELULAR DE TRIACILGLICEROLES Control PE B mg TAG/mg prot : 0.5 ± 0.025 0.50 ± 0.036 Oil Red O staining of differentiated cells. Fully differentiated (day 10) 3T3-L1 cells were treated for 15 hours with and without grape seed procyanidins B extract (PE) 100 µmol/L and subsequently stained for lipid accumulation with Oil Red O.

Las procianidinas modifican el metabolismo de la célula adiposa: Activando la lipólisis Interaccionando con receptores b-adrenérgicos Con la mediación del PPARg Modificando la lipogénesis. Las procianidinas parecen limitar la diferenciación de la célula adiposa. Las procianidinas modifican el metabolismo de la célula adiposa: Activando la lipolisis interaccionando con R-b-adrenérgicos con la mediación de PPARg Frenando la lipogénesis

Efectos de los flavonoides del vino sobre: El peso corporal ESTUDIO EXPERIMENTAL Efectos de los flavonoides del vino sobre: El peso corporal El metabolismo de los triglicéridos y el colesterol in vivo El metabolismo lípidico in vitro El metabolismo glucídico in vivo El metabolismo de la glucosa in vitro

DISEÑO EXPERIMENTAL Animales sanos (rata Wistar macho de 250g) Situación post-prandial Administración oral (sonda intragástrica) Dosis elevada de extracto de procianidinas (250 mg EP/kg de peso) Efecto a corto plazo (5 horas) Animales diabéticos por tratamiento con estreptozotocina

EFECTO HIPOGLUCEMIANTE DE LOS COMPUESTOS FENÓLICOS.

Efectos de los flavonoides del vino sobre: El peso corporal ESTUDIO EXPERIMENTAL Efectos de los flavonoides del vino sobre: El peso corporal El metabolismo de los triglicéridos y el colesterol in vivo El metabolismo lípidico in vitro El metabolismo glucídico in vivo El metabolismo de la glucosa in vitro

Estudio con cultivos de células sensibles a insulina EFECTO DE LOS COMPUESTOS FENÓLICOS SOBRE LA CAPTACIÓN DE GLUCOSA. Estudio con cultivos de células sensibles a insulina MW % monómeros % dímeros % oligómeros % oligómeros (3-4 unidades) (5-13 unidades) EP 1399 21.3 17.4 41.3 20 Extracto de procianidinas (EP) MITUBOS L6E9 ADIPOCITOS 3T3-L1

CAPTACIÓN DE GLUCOSA POR CÉLULAS SENSIBLES A LA INSULINA Captación de glucosa en miotubos L6E9 Captación de glucosa en adipocitos 3T3-L1 pmol gluc /mg prot.min Incubación mixta con insulina y procianidinas en miotubos L6E9 Los compuestos fenólicos aumentan la captación de glucosa. En miotubos no existe efecto aditivo ni estimulador.

MODIFICACIÓN DE LA CAPTACIÓN DE GLUCOSA Estudio con wortmanina, inhibidor específico de la enzima PI3K Wo 100 nM Ins 100 nM Ins+Wort EP 140 mg/L EP+Wort Captación de glucosa en adipocitos 3T3-L1 d b b d Wort Ins 1 uM Ins+Wort EP 15 mg/l EP+Wort ab d Captación de glucosa en miotubos L6E9 La inhibición de la estimulación del transporte de glucosa de forma equivalente a la inducida por wortmanina, sugiere que los compuestos fenólicos utiliza una vía equivalente a la de la insulina o requiere la enzima para hacer su efecto.

ACTIVACIÓN Y TRANSLOCACIÓN DE GLUT-4 EN ADIPOCITOS 3T3-L1 pmol gluc /mg prot.min ACTIVACIÓN GLUT-4 La adición de SB 203580 muestra una inhibición del 10% del transporte, sugiriendo que la activación del GLUT-4 está activada por compuestos fenólicos. ab SB: SB203580, inhibidor del transportador sensible a la insulina 50 KDa c b Control EP Insulina Control EP Insulina Membrana plasmática Endosomas GLUT-4 TRANSLOCACIÓN GLUT-4 La activación de GLUT-4 punto clave de la regulación del transporte de glucosa está mediado por la p38 quinasa. La adición del inhibidor SB 203580 del transportador sensible a insulina muestran una inhibición de un 10% del transporte. Indicando que la activación de Glut4 está activada por procianidinas. Las procianidinas inducen una translocación de los transportadores Glut 4 del compartimento endosomal que dan cuenta de x3,5 veces el observado en el grupo control e inferior a la translocación inducida por insulina. Los compuestos fenólicos inducen una translocación de GLUT-4 del compartimiento endosomal, 3,4 veces superior al control, pero inferior al inducido por la insulina.

CAPTACIÓN DE GLUCOSA POR CÉLULAS SENSIBLES A LA INSULINA Las procianidinas ejercen un efecto similar a la insulina en la célula muscular y la adiposa, estimulando la captación de glucosa y compartiendo un punto clave de la vía de señalización de la insulina: la activación de la PI3K. En la célula adiposa, las procianidinas estimulan la captación de glucosa ejerciendo un efecto potenciador del efecto de la insulina . Actúan movilizando la translocación a la membrana plasmática y posterior activación de GLUT-4.

CONCLUSIÓN Las procianidinas modifican el metabolismo actuando sobre sistemas de señalización celular y sobre la expresión génica. Inducen una situación metabólica que contrarresta el síndrome metabólico. Este efecto puede explicar su efecto cardioprotector descrito por los estudios epidemiológicos.

II JORNADA “ACTUALIZACIÓN EN ALIMENTACIÓN Y SALUD” Muecia, octubre de 2004 LOS FLAVONOIDES DEL VINO COMO AGENTES PROTECTORES DEL SÍNDROME METABÓLICO Dr. Lluís Arola Ferrer Universidad Rovira i Virgili de Tarragona Departamento de Bioquímica y Biotecnología