Q.F Heinz Jungbluth Ganoza Lima, UIGV, Junio 2013 Química de los Flavonoides, Aislamiento y caracterización de Isoflavonas y su Actividad Biológica Q.F Heinz Jungbluth Ganoza

Introducción Pigmentos naturales con una estructura carbonada C3-C6-C3 o mas, específicamente con un grupo fenilbenzopirano, dependiendo de la unión del grupo aromático con el núcleo benzopirano (cromano) serán, flavonoides 2-fenilbenzopirano, isoflavonoides 3-benzopirano, neoflavonoides 4-benzopirano

2-fenil Benzopirano

Isoflavonoides

Neoflavonoides

Flavonoides Minoritarios

Botánica

Isoflavonas Distribución: Las Isoflavonas se hayan presentes mayoritariamente en la familia de las leguminosas (Fabaceae) , preferentemente en la subfamilia papilionideae, existen grandes revisiones de investigaciones sobre la presencia de Isoflavonas en esta subfamilia como la de Veitch (2007, 2009). Se encuentran presentes en los frutos de esta familia (Legumbre) y en las raíces o rizomas (mecanismo de fijacion de Nitrogeno)

Química

Isoflavonas Características químicas resaltantes: Las isoflavonas difieren de sus respectivos flavonoides por la migración de un anillo aromático de C2 a C3. Mayores cambios en la estructura dependerán de su Hidroxilacion, metoxilacion, o metilendioxisustitucion, prenilacion y Glicosilacion.

Isoflavonas

Biosíntesis

Biosíntesis Las Isoflavonas proceden de la ruta de los Fenilpropanoides, pero el paso crucial para convertirse en Isoflavonas esta en la conversión de la respectiva flavanona en una Isoflavona, la enzima que realiza este proceso es la 2-hidroxiisoflavanona sintetasa (2HIS) luego se produce una dehidratación mediante la 2-hidroxiisoflavona dehidrasa convirtiéndola en una Isoflavona( todas estas enzimas ya han sido caracterizadas convenientemente)

Biosíntesis Regulación: La vía del ácido shikímico es dependiente de la luz. La acción de la fenilalanina amonioliasa, que inicia la vía biosintética de los flavonoides, es fundamental para la vida de las plantas y por ello está estrictamente regulada. Entre otros factores, la fenilalanina amonioliasa es activada por la luz, y depende además de la concentración de diferentes hormonas vegetales. La actividad de la fenilalanina amonioliasa suele aumentar cuando a los vegetales se les somete a situaciones de estrés, como puede ser la falta de agua ("estrés hídrico"), infecciones fúngicas o bacterianas, radiaciones UV, y el frío (por esto último las plantas sometidas a bajas temperaturas suelen presentar coloraciones rojizas en tallos y hojas, y cuando los inviernos son muy fríos, las flores desarrollan colores muy intensos en la primavera siguiente). Hay isozimas dedicadas a la producción de flavonoides diferentes en respuesta a señales ambientales diferentes

Fitoquímica

- Colectar planta completa, SECUENCIA DE INVESTIGACION DESECACION OBTENCION DEL MATERIAL IDENTIFICACION - Por un botánico de experiencia - Buen manejo de literatura - Guardar muestra herborizada - Para eliminar H2O y evitar alteración. - Hacerle gradualmente-- cambios de lugares. - Aire libre, en el sol sobre papel que se cambia diariamente. - Estufa: temperatura controlada+ aire forzado - Colectar planta completa, flor y fruto. - Por duplicado. - Anotar nombre vernáculo y científico. - Hábitat, tamaño, aspecto y color de los órganos recogidos - Clima, altitud, abundancia o escasez de la especie. - Una foto.

PROCESO DE INVESTIGACION FITOQUIMICA Obtención del material vegetal Desecación y conservación (estabilización) Identificación taxonómica y sus partes Tamizaje fitoquimico Extraccion P. activos Aislamiento y caracterización del P. A Formulación PROCESO DE INVESTIGACION FITOQUIMICA

Aislamiento Existen muchas vias de aislar y separar una isoflavonas, lo mas importante es reconocer el material del cual se esta extrayendo (material vegetal, muestra biológica, Alimento), la presencia de carbohidratos y compuestos lipofilicos, afectara el desarrollo del metodo.

Aislamiento SPE: (Solid Phase Extraction): Para poder evitar la mayor cantidad de interrupciones en la matriz, como medio de purificación podemos utilizar cartuchos de SPE C1; eluyendo el extracto en el cartucho y luego pasando a través del mismo MeOH con pequeñas concentraciones de Acido acético.

Aislamiento Partiendo de una muestra vegetal: La utilización de Material Seco, podría hacer decrecer la presencia de Isoflavonas, de preferencia utilizar material fresco. Flavonoides altamente acilados suelen ser lábiles a temperaturas muy altas y frecuentemente son degradados durante el proceso de secado.

Aislamiento Si estamos buscando agliconas en el material vegetal, podemos realizar un lavado con solventes no polares como el caso de cloruro de Metileno, éter di etílico, acetato de etilo. (aunque se encuentra raramente bajo la forma de agliconas) Normalmente la extracción podemos realizarla bajo un equipo soxhlet a 60 C durante 2 horas y comprobar la presencia de Agliconas en dicho extracto. Luego podemos proceder a realizar una extracción con mezclas de MeOH: H2O, la eficiencia de la extracción puede mejorar con sonificacion del material vegetal

Aislamiento Los flavonoides en el material vegetal se encuentran siempre conjugados con o-glic o c-glic, raramente se encuentra bajo la forma de aglicona. Para casos practico de aislamiento sera necesario separar estos glucósidos del esqueleto de los flavonoides, para esto se propone una hidrolizar acida.

Aislamiento Sistemas Cromatográficos para la extracción: existen varios sistemas para la extracción de las Isoflavonas mediante columnas Cromatográficas. Fases estacionarias: Poliamida, Sephadex LH20, C18 RP Fases Móviles: Migración y mixturas de compuestos Polares a Hidrófobicos

Solventes de desarrollo -Hexano -Tetracloruro de carbono -Benceno -Diclorometano -Cloroformo -Eter dietilico -Acetato de etilo -Acetona -Isopropanol -Etanol -Metanol -Agua Aumenta el poder eluyente Serie eluotropa El poder eluyente aumenta con la Polaridad del disolvente Polaridad creciente

Extracción de Flavonoides Maceración lixiviación Filtración Separación por resina AMBERLITE XAD2 Recuperar en MeOH Rotaevaporar a 40C Disolver en Agua Aglicona Someter a Hidrólisis acida a 60C Glicosidos Extraer en BuOH y redisolver en MeOH

Caracterización Son moléculas difíciles de caracterizar, normalmente se determinan bajo el brillo en presencia de fluorescencia, de color azul intenso, que cambia a Marrón intenso en presencia de vapores de amoniaco.

Características espectrales de las Isoflavonas

Espectroscopia UV La banda II de absorción de las Isoflavonas normalmente ocurre en la región de 245-270 nm y generalmente no es afectada por el incremento de la Hidroxilacion del anillo B, pero si es desplazada bato crómicamente por Hidroxilacion del anillo A Características de las espectroscópicas: Isoflavonas Polioxigenadas, que tengan la banda II de absorción, entre 265 y 270 generalmente son trioxigenadas en el anillo A. La metilación o Glicosilacion de 7 o 4’-OH tiene un pequeño o muy pequeño efecto sobre el espectro UV, Mientras que una sustitución en el 5-OH causa un ligero desplazamiento Hipsocromico.

Espectroscopia uv Reactivos de Desplazamiento

Técnicas Espectrométricas Los tipos de análisis mas importantes para el trabajo con flavonoides, son los relacionados con la Espectrometría de MS, MS/MS y la RMN 1H y RMN 13C. El trabajo con IR no ayuda en gran manera, debido a la cantidad de señales iguales, que se solaparían.

Espectrometría de masas

Espectrometría de masas Es una técnica instrumental sofisticada que separa y detecta iones en fase gaseosa. Se basa en ionizar moléculas gaseosas convirtiéndolas en iones (generalmente cationes), que se separan al ser acelerados por un analizador de masa: la separación se basa en la distinta relación m/z de los iones.

Introducción de la muestra ESPECTRÓMETRO DE MASAS Componentes del instrumento Fuente de ionización Separador de masas Detector iónico Introducción de la muestra Procesador de señal El acoplamiento entre CG y HPLC con EM se analizará más adelante Registrador

Ionización por impacto electrónico Ionización química Fuentes de ionización Ionización por impacto electrónico Ionización química Fuente de bombardeo con átomos rápidos Desorción con láser Ionización a presión atmosférica: - Electronebulización asistida con un gas: electrospray - Ionización química a presión atmosférica - Fotoionización a presión atmosférica HPLC

placas aceleradoras (4000 V) Ionización por impacto electrónico filamento de W moléculas neutras moléculas neutras placa de repulsión haz de electrones (70 eV) placas aceleradoras (4000 V) placas focalizadoras iones M + e M.+ + 2e ion molecular

Fragmentación del ion molecular Molécula hipotética ABCD (A, B, C y D = átomos) ABCD + e ABCD.+ + 2 e ABCD.+ A+ + BCD. A. + BCD+ BC+ + D CD. + AB+ AB. + CD+ B + A+ A + B+ D + C+ C + D+ Fragmentación del ion molecular ABCD.+ ADBC.+ BC. + AD+ AD. + BC+ Reordenamiento seguido de fragmentación Colisión seguida de fragmentación ABCD.+ + ABCD (ABCD)2.+ BCD. + ABCDA+

Ionización química Gas reactivo metano, isobutano, amoníaco (cámara de ionización de “alta” presión a 10 torr) CH4 + e (alta energía) CH4+ y CH3+ CH4+ + CH4 CH5+ + CH3 CH3+ + CH4 C2H5+ + H2 Transferencia protónica entre molécula reactiva y analito CH5+ + MH MH2+ + CH4 C2H5+ + MH M+ + C2H6

Separador de masas Espectrómetro de masas de sector magnético Espectrómetro de masas de cuadrupolo Espectrómetro de masas de tiempo de vuelo Espectrómetro de masas de trampa iónica

Espectrómetro de masas de sector magnético

¿cómo se separan los iones de distinta masa? m : masa v : velocidad de la partícula z : carga V : diferencia de potencial Ecinética = ½ mv2 = zV v = (2zV/m)½ FM = Bzv FC = mv2/r mv2/r = Bzv v = Bzr/m FM : fuerza centrípeta FC : fuerza centrífuga B : campo magnético r : radio de curvatura Bzr/m = (2zV/m)½ m/z = B2r2/2V

Espectrómetro de masas de cuadrupolo Ø = 6 mm

Espectrómetro de masas de cuadrupolo

Relación de voltajes durante un barrido de masa con un analizador cuadrupolo Potencial corriente directa tiempo masa Potencial de radiofrecuencia

EM de tiempo de vuelo (TOF: time of flight) pulsos de 300 V, 3.000-20.000 veces/s

electrodo anular central Espectrómetro de masas de trampa iónica Vrf electrodo anular central tapa tapa

Esquema detector de trampa iónica (ITP)

Espectros de masas Dependen de: Energía de ionización de la molécula Grupos funcionales de la molécula Método de ionización Presión y temperatura de trabajo Diseño instrumental

Espectros de masas obtenidos por impacto electrónico Etilbenceno pico base En este ejemplo el pico base se forma por pérdida de CH3 ion molecular (ion “parent”) molécula con número par de N → M+ con masa par M+ → fragmento de mayor masa molécula con número impar de N→ M+ con masa impar 4 H → M-4 F → M-19 CH3→ M-15 HF → M-20 NH3 → M-17 C2H2 → M-26 H2O → M-18 Átomos y grupos frecuentemente desplazados

Espectros de masas de cloruro de metileno Impacto electrónico pico base → pérdida de Cl 13C1H235Cl2 (m= 85) 12C1H235Cl37Cl (m= 86) 13C1H235Cl37Cl (m= 87) 12C1H237Cl2 (m= 88) Picos isotópicos 12C1H235Cl2 (m= 84)

Espectros de masas de pentobarbital (sedante) Impacto electrónico Ionización química El ion molecular (m/z = 226) prácticamente no se distingue

Espectros de masas de 1-decanol (PM = 158) Impacto electrónico Ionización química

Cromatografía Gaseosa – Espectrometría de Masas Sistemas de acople

Separador de chorro (columnas rellenas)

Ensamblaje con columnas capilares hacia la bomba cámara de evacuación A cámara de ionización desde el CG tubo de vidrio poroso constricción de entrada constricción de salida collarín que se atornilla en el receptáculo de fuente iónica

Cromatografía Líquida – Espectrometría de Masas Sistema de acople Sistema de ionización

Ionización a presión atmosférica Formación de iones gaseosos a partir de analitos en solución Ionización a presión atmosférica Electronebulización asistida con un gas: electrospray (ESI) Ionización química a presión atmosférica (APCI) Fotoionización a presión atmosférica (APPI)

Electronebulización asistida con un gas Electrospray (ESI)

Electrospray (ESI) 1. La fase móvil y el analito se nebulizan (dispersados en pequeñas gotas) 2. El solvente de la fase móvil se evapora de las gotas (desolvatación) 3. La densidad de carga en las gotas aumenta hasta alcanzar el límite Raleigh (10e8 V/cm3) y luego la gota sufre explosiones de Coulomb y se rompe en gotas más pequeñas. 4. Bajo la influencia de potenciales electrostáticos en la cámara de spray (nube), el ion analito se desorbe de la gota.

Electrospray aerosol líquido

¿Cuándo es apropiado trabajar en ESI? Solutos ionizables de alto y bajo peso molecular. El analito de interés debe ser capaz de portar carga en solución Ejemplos: a) Muestras que contienen heteroátomos: carbamatos, benzodiacepinas b) Ácidos o bases c) Especies iónicas: fosfatos, conjugados con grupos sulfato, aminas, etc d) Muestras que se multi-cargan en solución (ej: péptidos, proteinas, oligonucleotidos) e) Compuestos que pueden aceptar carga inducida A evitar: muestras con grupos no polares en los que la inducción de carga no sea un proceso eficiente

Ionización química a presión atmosférica APCI

Ionización química a presión atmosférica (APCI) 1. La fase móvil y el analito se nebulizan (dispersados en pequeñas gotas) 2. Las gotas se evaporan. 3. Las moléculas de fase móvil se ionizan por electrones provenientes de una descarga eléctrica. 4. Las moléculas de analito se ionizan por los iones de la fase móvil.

La muestra y el solvente vaporizados entran en la región corona entre la aguja y el capilar Las moléculas de solvente se ionizan en la región corona de descarga, transformándose en iones gaseosos reactivos Estos iones reactivos reaccionan con las moléculas de muestra, ionizándolas

Ionización química a presión atmosférica H3O+(H2O)16

¿Cuándo es apropiado trabajar en APCI? Muestras: Compuestos de peso molecular/polaridad intermedias: PAHs, PCBs, ácidos grasos, ftalatos. Compuestos que no contienen grupos ácidos/básicos (ej: hidrocarburos, alcoholes, aldehidos, cetonas y esteres) Muestras con heteroátomos: ureas, benzodiacepinas, carbamatos Muestras que exhiben un mal comportamiento ESI Parámetros en solución Mucho menos sensible a las condiciones de disolución que ESI Tolera mayores flujos que ESI Acomoda algunos solventes no compatibles normalmente con ESI Muestras a Evitar Debido a la evaporación previa: muestras térmicamente lábiles, muestras cargadas en solución, biomoléculas (habitualmente no volátiles).

Fotoionización a presión atmosférica APPI

APPI (modo positivo) El solvente y la muestra se nebulizan y son completamente vaporizados por calefacción. • La ionización del solvente y la muestra ocurre por bombardeo con fotones a partir de una lámpara UV

La molécula de analito M se ioniza a ion molecular (si el potencial de ionización del analito es menor a la energía del fotón). El ion M.+ puede extraer un hidrógeno del solvente para formar [M+H]+ Un dopante fotoionizable en exceso y rinde muchos iones moleculares. El analito se ioniza por transferencia protónica a partir del dopante o solvente El ión molecular del dopante ioniza al analito por transferencia electrónica

¿Cuándo usar APPI? Puede ionizar compuestos que no se ionizan bien con ESI o APCI (ej: PAHs). Tiene mejor sensibilidad global para algunos compuestos (THC-tetrahidrocanabinol, ácido benzoico, vitaminas no hidrosolubles). Tiene mejor sensibilidad a bajas velocidades de flujo que APCI. Es robusto y altamente reproducible.

Selección del sistema CL/EM 1.000 No polar Muy polar 10.000 100.000 Peso molecular Polaridad del analito ESI APCI APPI

Registros gráficos CG-EM y CL-EM Cromatograma de corriente iónica total Cromatograma de ión seleccionado Arreglo tridimensional: señal en función del tiempo (información cromatográfica) y en función de la relación m/z (información espectroscópica)

Síntesis de 1Br-butano a partir de butanol (CG-EM) CH3(CH2)3OH + Br- CH3(CH2)3Br + OH- 1-butanol 1-bromobutano cromatograma EM pico 1 EM pico 2

Combustión de tela tratada con producto ignífugo Cromatograma de corriente iónica total (TIC) EM de pico 12 (benceno)

Confirmación presencia de cocaína en orina por CG-masa Cromatograma de corriente iónica total EM de testigo de cocaína (m = 303) a igual tiempo de elución EM del pico a 11.5 min

Mezcla de 6 herbicidas resuelta por HPLC-masas Cromatograma convencional con detección UV Detección de un ion seleccionado m/z = 312 (corresponde a MH+ formado a partir de imazaquina de masa = 311) Cromatograma de masas de corriente iónica total

Representación de la estructura tridimensional de datos CG-EM en modo barrido completo (full-scan) Se obtiene: el cromatograma iónico total, el cromatograma iónico de un ión seleccionado (a determinada masa) y los espectros de masas (a determinados tiempos de retención)

MS en Flavonoides Cantidad de muestra necesaria: Menos de un 1mg, esta técnica junto con el análisis UV y los reactivos de desplazamiento. La técnica a escoger puede variar dependiendo de la matriz y tipo de flavonoides a analizar. (FAB, MALDI, TOF, EI) El análisis se debe llevar a cabo siempre con agliconas, esto debido a que los glucósidos son altamente termolábiles, incluso existiendo una gran presión de vacío (3 x10-5 Torr)

RMN Esta tecnica es muy usada para el analisis de flavonoides, especialmente en las isoflavonas, al ser estructuras altamente metiladas. Ademas de ser muy solubles en el solvente que se utiliza para la RMN CDCL3, sin embargo otra vez se observa que el analisis de los glicosidos, disminuye la solubilidad en CDCL3 Sin embargo el uso de DMSO d6, facilita de sobremanera el analisis de glicosidos. La utilizacion de TMS tambie es apropiada para el analisis de Flavonoides, ya que generan rapidamente derivados de estos.

Para la elucidación de la estructura tomaremos en cuenta los siguientes puntos: Protones del Anillo A Protones del Anillo B Protones del Anillo C Protones del Glucósido Metoxi y Acetoxi Protones Protones del carbono 6 y 8 Nota: Tener en cuenta si se usa TMS, todos los OH terminales seran Trimetilsilil esteres.

Los protones de los carbonos 6 y 8 de las isoflavonas que contengan sustituciones en los carbonos 5 y 7, presentaran 2 dobletes (J: 2.5cps) en el rango de 6.0 y 6.5. Los dobletes correspondientes a H-6 ocurren consistentemente mas altos que los del 8-H, cuando existen azucares en el C-7 la señal se desplaza en el espectro

Otro caso común es que la isoflavona presente una sustitución en el C-7 Cuando R=H, tenemos que los hidrogenos del carbono 5 genera un doblete entre 7.9 y 8.2, El carbonos 6 generara un cuarteto entre 6.7 y 7.1 y el carbono 8 un doblete entre 6.7 y 7.0, cuando la sustitución es diferente a la de un H, todos los desplazamientos se ven reducidos.

Anillo B: para nuestro interés en las isoflavonas, los desplazamientos como dobletes entre 7.2 y 7.5 y 6.5 y 7.1, nos darán la explicación de un enlace =C-C= en la posición 3, corroborando la presencia de la estructura correspondiente a las Isoflavonas.

Farmacología

Isoflavonas Las Isoflavonas presentan una gran cantidad de actividades, aunque cabe resaltar que la mayor cantidad de Isoflavonas presentar actividad estrogénica, de ahí que reciben el nombre de Fitoestrógenos. Estos compuestos presentan una estructura estérica muy similar a la de esteroidal de los estrógenos, por lo cual se unen fácilmente a los receptores estrogénicos. De ahí que produces una infinidad de efectos estrogénicos o anti estrogénicos.

Absorción, Metabolismo y excreción Las isoflavonas son absorbidas a nivel de la parte superior del intestino delgado. Pasan la barrera hematica alrededor de una hora después de haber sido ingeridas. Son absorbidas bajo la forma de aglicona, por lo que previamente se realizada un hidrolisis enzimática, por la B-glicosidasa de la flora bacteriana o por la enzima instestinal, lactasa-florizina hidrolasa.

Absorción, metabolismo y excreción Posteriormente a nivel de la mucosa intestinal son convertidas a la forma de B-glucoronico por la enzima UDP-Glucoroniltransferasa , convertida luego bajo la forma de sulfato catalizado por PAPS. Estos procesos ocurren a nivel del Hígado. Luego estos son excretados a nivel biliar, y reabsorbido en la porción final del intestino delgado, creando un ciclo entero-hepatico. Para ser luego excretado vía urinaria, bajo la forma de DMA (desmethylangolensin).

Mecanismo de Acción Síntomas Menopaúsicos: Las isoflavonas con su estructura estérica similar a la del estrógeno, se une a sitio receptor de estrógenos, produciendo efectos vasomotores importantes, diversos estudios clínicos, dan como dosis diaria 135 mg de Isoflavonas expresadas como mg de Genisteina.

Efectos Benéficos Anticancerígeno: Uno de las posibles explicaciones, o modelos de mecanismo de acción es tan indicados a que las isoflavonas, evitan la proliferación de células cancerígenas activando las vías de apoptosis, inhibición de la Tirosina Quinasa, y regulación de los ciclos hormonales.

Efectos Benéficos Efectos sobre la cognición: El hecho de activar receptores hormonales, da como resultado un incremento en la producción de neurotransmisores, lo cuales van a producir una mayor actividad cerebral, llegando a mejorar los procesos cognitivos del cerebro.

Practica de Laboratorio Traer: Mta problema (planta, material vegetal, materia biologico), que contenga una cantidad y molecula conocida de Isoflavonas. Jeringas de 10 ml Guantes Guardapolvos Muchas Ganas de trabajar

FIN Gracias