Otras PCR: PCR en tiempo real (cuantitativa) Curso PCR 2011-12 Inmaculada Martín Burriel minma@unizar.es Curso PCR 2011-2012

Programa: Miércoles 18 de enero (10 h) Aula Grados: PCR en Tiempo Real (teoría) Aplicaciones de la PCR en Tiempo Real: Diagnóstico, expresión génica, análisis mutaciones. Ejemplo: Perfiles de expresión génica en scrapie Protocolo experimental (15 h) Aula Grados Diseño de primers y sonda (Primer express). Validación de primers. Optimización de la reacción: Matriz de primers Matriz de sonda Curva standard. Normalización de datos de expresión Curso PCR 2011-2012

Programa: Jueves 19 de enero (10h) LAGENBIO: Práctica: Realización de una PCR en tiempo real. Aplicaciones de la PCR en Tiempo Real : Diagnóstico, expresión génica, análisis mutaciones. Ejemplo: Perfiles de expresión génica en scrapie Curso PCR 2011-2012

PCR clásico La cantidad de producto no está relacionada con la cantidad de DNA inicial Herramienta cualitativa (presencia o ausencia) El bromuro de etidio es poco sensible, cuando se detecta ya se ha sobrepasado la fase exponencial Curso PCR 2011-2012

Técnicas de cuantificación Northern Blot Curso PCR 2011-2012

Early expression of p53 responsive genes (24h) PCR Competitivo o PCR “Mimic” Early expression of p53 responsive genes (24h) Bax CD95/Fas GAPDH L C 6 8 10 12 M Curso PCR 2011-2012 Martín-Burriel et al. (2004)

Overexpression of antiapoptotic and carcinogenic related markers PCR Competitivo o PCR “Mimic” Overexpression of antiapoptotic and carcinogenic related markers Bcl-2 Tgf-b1 c-myc L C 6 8 10 12 M Curso PCR 2011-2012

PCR Competitivo o PCR “Mimic” Curso PCR 2011-2012 Martín-Burriel et al. (2004) Toxicol Pathol

Necesidad de PCR en tiempo real Necesidad de cuantificar diferencias de expresión de un mRNA Disponibilidad de muy pequeñas cantidades de mRNA en algunas prácticas laboratoriales: Células obtenidas de microdisección por láser Pequeñas cantidades de tejido Biopsias embrionarias Especimenes de gran valor Curso PCR 2011-2012

Permite observar la cinética PCR en Tiempo Real Nuevos químicos Nuevas plataformas instrumentales Detección de productos PCR en tiempo real Permite observar la cinética de la reacción Curso PCR 2011-2012

Fases de la PCR Exponencial: En cada ciclo se dobla el producto. Lineal: enlentecimiento, consumo de componentes, principio de degradación. Meseta: Parada de la reacción, agotamiento de componentes, degradación de productos. Curso PCR 2011-2012

Fases de la PCR Logarítmica Lineal Curso PCR 2011-2012

Detección en la fase exponencial Curso PCR 2011-2012

Detección en la fase de meseta Problemas de cuantificación en la fase de meseta Curso PCR 2011-2012

PCR en Tiempo Real Toma los datos mientras se producen. Cuantificación más exacta sin necesidad de métodos laboriosos. Existe una relación cuantitativa entre la cantidad inicial y la cantidad de producto PCR en un ciclo dado. Curso PCR 2011-2012

Flurocromos: SYBR Green Se intercala en el surco menor del ADN de doble cadena y emite fluorescencia. No es equimolecular. Necesaria curva de disociación. Curso PCR 2011-2012

Curva de disociación Tª Melting: Composición de bases del fragmento Tamaño del fragmento. Tm dimeros < Tm fragmento En el punto de melting, las dos cadenas de DNA se separarán y la fluorescencia disminuye rápidamente. El software presenta la tasa de cambio de unidades de fluorescencia relativas con el tiempo en el eje Y (-d(RFU)/dT y la temperatura en el eje X. EL pico será la temperatura de meltimg Tm del fragmento Curso PCR 2011-2012

Curva de disociación Curso PCR 2011-2012

Curva de disociación Muestras problema Controles negativos y sin RT Curso PCR 2011-2012

Ventajas e inconvenientes PCR con SYBR Green: Más barato Los mismos reactivos sirven para analizar cualquier fragmento La especificidad viene dada únicamente por los primers No es equimolecular Se necesita realizar una curva de disociación Curso PCR 2011-2012

Sondas TaqMan Actividad 5’ exonucleasa de la Taq polimerasa. Reporter: FAM, VIC. Quencher: TAMRA. Importante tªm (~70ºC). Equimolecular. Curso PCR 2011-2012

Especificidad Diseño de sondas entre dos exones Curso PCR 2011-2012

Equimolaridad TaqMan SYBR Green Curso PCR 2011-2012

Sondas MGB NFQ: Quencher oscuro, no emite fluorescencia. Disminuye Baseline. Aumenta sensibilidad. MGB: Se une al surco pequeño. Aumenta la Tªm. Aumenta la eficiencia. MGB R NFQ Curso PCR 2011-2012

Ventajas e inconvenientes PCR con Sondas TaqMan: Más caro Utilización de sondas específicas para cada fragmento a analizar La especificidad viene dada por los primers y la sonda Es equimolecular No necesita curva de disociación Curso PCR 2011-2012

Aplicaciones de la PCR-TR Glosario de términos. Cuantificación: Absoluta Relativa Determinación de mutaciones. Ensayos +- Curso PCR 2011-2012

Aplicaciones de la PCR-TR Glosario de términos. Cuantificación: Absoluta Relativa Determinación de mutaciones. Ensayos +- Curso PCR 2011-2012

Glosario de términos Cuantificación: Absoluta: Relativa: Resultado final con unidades (carga viral, copias de mensajero, copias de un gen,...). Se necesita una curva patrón absoluta. Relativa: Resultado sin unidades. Proporciona un porcentaje de incremento o disminución (expresión génica). Se necesita curva patrón (al menos para prueba de primers). Curso PCR 2011-2012

Glosario de términos Referencia: Calibrador: Señal utilizada para normalizar el experimento. Pasiva: Fluorocromo en todos los tubos (ROX). Activa: endógena (housekeeping) o exógena (construcción). Calibrador: Muestra que usamos para comparar las demás. Curso PCR 2011-2012

Glosario de términos Standard (patrón): Threshold (umbral): Muestra de concentración conocida que nos permite construir la curva de calibrado. Threshold (umbral): Ct es el ciclo en el cual se detecta un incremento significativo de DRn (fluorescencia). El sistema empieza a detectar la señal asociada al incremento exponencial de producto PCR (Fase exponencial) Curso PCR 2011-2012

Aplicaciones de la PCR-TR Glosario de términos. Cuantificación: Absoluta Relativa Determinación de mutaciones. Ensayos +- Curso PCR 2011-2012

Métodos de cuantificación Curva estándar Delta Ct Método de Pfaffl Curso PCR 2011-2012

Curva estándar Curso PCR 2011-2012

Curva estándar Curso PCR 2011-2012

Curva Patrón y=ax+b. Y=Ct, X=log [DNA]. Relaciona cada concentración con su Ct. Propia de cada pareja de primers. La pendiente depende de la eficiencia de los primers y no debería cambiar entre experimentos: 100% (a=-3.32). 75% (a=-4). Aceptable:-3 ≤ -4. a> -3 contaminación por fluorescencia. Curso PCR 2011-2012

Curva Patrón Correlación (R2): Nº de réplicas: Muestra: R2=1 (perfecta). R2≥0.97 (0.99). Seleccionar el umbral donde R2 sea máxima. Mantener el umbral entre experimentos. Nº de réplicas: Al menos 2 réplicas por muestra. Desviación estándar ≤ 0.38 Muestra: Curva absoluta: muestra de [] conocida. Diluciones 1/5. Curso PCR 2011-2012

1. Cuantificación Absoluta Validación de la curva patrón: La precisión de la cuantificación dependerá de la precisión de los patrones. Patrones: DNA plasmídico. DNA genómico. Productos PCR. Grandes oligonucleótidos comerciales. Resultado final relativo a una unidad de interés: Copias/ng de RNA Copias/g tejido, copias/ml sangre. Copias/genoma. Copias/ célula. ATENCION DENOMINADOR Curso PCR 2011-2012

1. Cuantificación Absoluta Posibles curvas de calibrado (Expresión génica): Productos de RT-PCR u oligonucleótidos: Rápido, conocimiento preciso de [DNA]. Inestable, problemas en la reamplificación. DNA recombinante: Muy estable, sin problemas de amplificación, talla similar a transcritos. Construcción del DNArec, no tiene en cuenta la eficacia de la RT. RNA recombinante: Mimetiza la situación real de retrotranscripción (añadir RNA background). Muy inestable, clonación complicado, purificación, problemas de almacenamiento. Curso PCR 2011-2012

1. Cuantificación Absoluta Puntos críticos de la curva patrón: DNA o RNA puro y muy concentrado. Exactitud en la medida de la concentración inicial (7 veces). Pipeteo apropiado: dilución del DNA o RNA original hasta concentraciones similares a las muestras biológicas (106-1012). Estabilidad de las muestras patrón (RNA). Curso PCR 2011-2012

2. Cuantificación Relativa Curva patrón: Sencillez en la preparación. La cantidad de producto (n veces) se refiere a la obtenida en el calibrador (1x). No hay unidades. Se puede utilizar cualquier tipo de patrón para la obtención. Curso PCR 2011-2012

2. Cuantificación Relativa Puntos críticos de la curva patrón: Dilución adecuada del RNA o DNA patrón. La utilización de las mismas muestras en placas distintas permite comparar resultados. Se pueden utilizar patrones DNA para análisis de RNA. Se necesitan curvas patrón para el gen de estudio y el control endógeno. Curso PCR 2011-2012

Cuantificación de la expresión génica Referencia activa: Muestra 1 Muestra 2 Gen problema 4 8 Control endógeno 2 16 ratio 0.5 Control de la eficiencia de la Retro-transcripción. Control de la eficiencia de la extracción de RNA. Buscar referencias bibliográficas. Utilizar tres endógenos. Curso PCR 2011-2012

Análisis de expresión CON curva patrón Gen Referencia: GAPDH Gen Estudio: SPP1 21.58 27.68 16.62 27.36 -1.92 0.0121 -0.42 0.38 -0.3 0.49 -0.2 0.627 Cantidad relativa Cantidad relativa T0 T7 0.49/0.0121 0.627/0.38 = 24.54 Qgen trat/Q norm trat =Fold Change Q gen Ctrl/Q norm Ctrl Curso PCR 2011-2012

Cuantificación Relativa La eficiencia de la PCR puede enmascarar resultados. Curso PCR 2011-2012

Método de Pfaffl (2001) Eficiencia: pendiente de la curva patrón Curso PCR 2011-2012 http://pathmicro.med.sc.edu/pcr/dnaveff.jpg

Método de Pfaffl (2001) eficiencia =10-1/pendiente Si la eficiencia es del 100% e=10-1/-3.32=2 Curso PCR 2011-2012

Análisis de expresión SIN curva patrón Método de comparación de Ct= 2-DDCt DDCt= DCt , muestra-DCt, calibrador DCt , muestra: Valor de Ct para una muestra normalizado con el del control endógeno. DCt , calibrador: Valor de Ct para el calibrador normalizado con el del control endógeno. Expresión gen/ Expresión basal del gen =2-DDCt Expresión endógeno/ Expresión basal endóg Curso PCR 2011-2012

Análisis de expresión SIN curva patrón Método de comparación de Ct Se basa en la eficiencia de los primers Se refiere a la muestra con mayor cantidad de gen de estudio (o menor Ct) Q = e(menor Ct- Ct muestra) e =10-1/pendiente Si la eficiencia es del 100% e=10-1/-3.32=2 Ejemplo Curso PCR 2011-2012

2. Cuantificación Relativa PCR Múltiple: Amplificación del gen de interés y el endógeno en el mismo tubo. Reporter: 6-FAM y JOE. Evitar competición en la reacción: Limitar la concentración de primers del gen más abundante. Curso PCR 2011-2012

Cuantificación Relativa Elección del método: Estudio del gen de interés y del endógeno en tubos distintos y usar curva patrón: Rápida optimización y validación. Utilización del método 2-DDCt : Se necesitan eficiencias de amplificación similares. No necesita curva patrón. Elimina los errores de dilución de la curva patrón. Preferible el método de Pfeffl una vez calculada la eficiencia PCR Múltiple: Más puesta a punto. Mayor rapidez de análisis. Curso PCR 2011-2012

Aplicaciones de la PCR-TR Glosario de términos. Cuantificación: Absoluta Relativa Determinación de mutaciones. Ensayos +- Curso PCR 2011-2012

Polimorfismo de SNPs Sondas alelo-específicas. Utilización de sondas MGB/NFQ: Mayor discriminación. Utilización de oligos alelo-específicos y SYBR Green. Las curvas de disociación discriminan alelos. Curso PCR 2011-2012

Componentes de la reacción Metodología ryr-1: CTG TGT TCC CTG TGT GTG TGC AAT GGT GTG GCC GTG GC TCC AAC CAA GAT CTC ATT ACT GAG AAC TTG CTG CCT GGC CGC C T Forward G Sonda 1 Sonda 2 A FAM VIC Reverse Protocolo: Componentes de la reacción Volumen / Reacción (ml) Final concentración TaqMan® Universal PCR Master Mix, No AmpErase® UNG (2X) 12,5 1X 40X Assay Mix (Mescla de cebadores y sondas) 0,625 DNA 2 1-20 ng H2O 9,875 --- Total 25 Pre-lectura: 60ºC 1min PCR: 95ºC 10min 92ºC 15sec 60ºC 1min (x50) Post-lectura: 60ºC 1min Curso PCR 2011-2012

Resultados CT CC NTC TT Curso PCR 2011-2012

Aplicaciones de la PCR-TR Glosario de términos. Cuantificación: Absoluta Relativa Determinación de mutaciones. Ensayos +/- Curso PCR 2011-2012

Ensayos +/- Se marca el ensayo con sonda TaqMan o SYBRGreen. Adición de un control interno positivo (control de amplificación). Eliminar Falsos Negativos Curso PCR 2011-2012

Programa: Viernes 14 de enero (9:30 h) Aula Máster: PCR en Tiempo Real (teoría) Aplicaciones de la PCR en Tiempo Real: Diagnóstico, expresión génica, análisis mutaciones. Ejemplo: Perfiles de expresión génica en scrapie Curso PCR 2011-2012

Programa: Miércoles 20 de enero Aula Máster : Práctica: Realización de una PCR en tiempo real. Protocolo experimental: Diseño de primers y sonda (Primer express). Validación de primers. Optimización de la reacción: Matriz de primers Matriz de sonda Curva standard. Normalización de datos de expresión Ejemplo: estabilidad de HKG en scrapie. Curso PCR 2011-2012

Diseño primers Tamaño amplicon: 50-150pb %GC: 20-80% Máximo 2/5 G o C en el extremo 3’ Longitud: 9-40pb (mejor 20pb, no se recomiendan longitudes <18pb) Curso PCR 2011-2012

Diseño de primers y sonda (Primer express). La sonda esta entre los dos exones bax Curso PCR 2011-2012

Diseño de primers Tm: 58-60ºC Tm: Tª en la que el 50% de las cadenas está unida y el 50% despegada Si se pega más del 50%más posibilidad de inespecificidades En tiempo real: Tª=Tm Diferencia de Tm entre los dos primers < 2ºC Curso PCR 2011-2012

Diseño de primers PCR: 60ºC [Primer F] Primer F: Tm 58ºC Primer R: Tm 60ºC PCR: 60ºC [Primer F] Curso PCR 2011-2012

Matriz de Primers Primer Forward Primer Reverse 50nM 300nM 900nM 2X Curso PCR 2011-2012

Matriz de primers < Ct  > Sensibilidad > Rn  primers no limitantes Curso PCR 2011-2012

Diseño de sondas Tm sonda 10ºC > Tm primers Tm 70ºC la sonda se une inmediatamente antes de la mayor eficiencia de la polimerasa GC: 20-80% Longitud: 9-40b (si >30b sonda MGB) Nunca puede haber G en el extremo 5’ (quencher natural) <4G continuas Procurar [C]>[G] Curso PCR 2011-2012

Componentes de la reacción Matriz de sonda Se realiza tras la optimización de los primers (para ello sonda a 250nM) Utilizar distintas [sonda]: de 25nM a 225nM Componentes de la reacción Volumen / Reacción (ml) Final concentración TaqMan® Universal PCR Master Mix, No AmpErase® UNG (2X) 12,5 1X Forward 1 900/300/50 nM Reverse Sonda 1,25 250 nM H2O 8,25 --- DNA 50 ng Total 25 Curso PCR 2011-2012

Matriz de sonda < Ct  > Sensibilidad > Rn  no limitante 250 nM 200 nM 150 nM 100 nM 50 nM < Ct  > Sensibilidad > Rn  no limitante Curso PCR 2011-2012

Recta patrón Gen Referencia Nos muestra la eficiencia de los primers: Curso PCR 2011-2012

Recta Patrón: Gen de estudio bcl2 Curso PCR 2011-2012

bax Curso PCR 2011-2012

Control de la curva patrón Seleccionar el umbral (manualmente) para obtener la mayor correlación (>0.99) Asegurarnos de que las curvas de melting son adecuadas Confirmar que las pendientes de las muestras son iguales en vista logarítmica Eliminar muestras de las diluciones que se entrecrucen Eliminar muestras que se amplifican a Ct<10 La curva debe tener 5 o + puntos Curso PCR 2011-2012

Etapas del análisis de expresión Extracción de RNA Retrotranscripción Análisis de la expresión del gen (genes) de referencia Análisis de la expresión del gen de estudio Normalización Análisis de los resultados Curso PCR 2011-2012

Retrotranscripción El paso más delicado por la baja eficiencia de la enzima Distintas retrotranscriptasas en función del experimento: Expresión génica (MLMv o modificaciones) rTth DNA polimerasa (virus y fragmentos de RNA difíciles) Primers: Random Hexamers expresión Poly(dT) Específico (la eficiencia de la RT dependerá del primer) virus Curso PCR 2011-2012

Errores más comunes Mal diseño de primers y sondas: Utilizar software: Obtener la Tm óptima, Evitar complementariedad entre primers, Observar estructura secundaria Atención al tamañio del amplicón Elegir primers en la unión de exones Eficiencia pobre Pobre calidad del RNA: Los amplicones cortos (70-250bp) toleran cierta degradación Para una buena cuantificación, evitar la degradación Curso PCR 2011-2012

Errores más comunes No utilizar master-mix: Contaminación: Los errores de pipeteo se amplifican Minimiza la variación entre muestres y réplicas Rox en master-mix. Contaminación: Utilizar siempre un NTC No utilizar un “–RT” control Curso PCR 2011-2012

Errores más comunes Usar un control de normalización inadecuado: Elegir controles estables ¿Existen referencias bibliográficas en nuestro modelo? No hacer curvas de disociación con SYBR-Green: Podemos “cuantificar dímeros” o bandas contaminantes No elegir adecuadamente “baseline” y “threshold” Baseline: 2 ciclos antes que el Ct de la muestra más abundante Threshold: en fase exponencia (al menos a 10 desviaciones estándar del inicio de baseline Utilizar curvas estándar de rango inapropiado Curso PCR 2011-2012