HPLC (High-performance liquid chromatography) MARISOL CAÑATE CARMEN CAROLINA CUELLO LEONARDO FABIO RAMIREZ NASSER REDONDO LUQUEZ ANDRES FELIPE RIVERA VALERA DIANA CAROLINA VALLEJO MONTENEGRO

HPLC Es una técnica utilizada para separar los componentes de una mezcla basándose en diferentes tipos de interacciones químicas entre las sustancias analizadas y la columna cromatográfica.

En general… En una cromatografía participan: Fase estacionaria Fase móvil Muestra

¿Cómo interaccionan? En general, una cromatografía se realiza permitiendo que la mezcla de moléculas que se desea separar (muestra) interaccione con un medio o matriz de soporte que se denomina fase estacionaria. Un segundo medio (la fase móvil) que es inmiscible con la fase estacionaria se hace fluir a través de ésta para "lavar" (eluir) a las moléculas en la muestra.

HPLC La cromatografía de líquidos de alta resolución, es un modo de cromatografía en la cual el proceso de separación y transferencia de masa es entre la fase estacionaria y la fase móvil y una temperatura dada.

HPLC La HPLC, representa una de las herramientas más empleadas en el laboratorio analítico moderno. La cromatografía es un método, usado primariamente para la separación de los componentes de una muestra, en la cual los componentes se distribuyen en dos fases. Las muestras no necesitan ser vaporizadas para su análisis. Cualquier sustancia puede ser potencialmente analizada por esta técnica.

HPLC En la HPLC, el compuesto pasa por la columna cromatográfica a través de la fase estacionaria (normalmente, un cilindro con pequeñas partículas redondeadas con ciertas características químicas en su superficie). Esto lo hace mediante el bombeo de líquido (fase móvil) a alta presión a través de la columna. La muestra a analizar es introducida en pequeñas cantidades y sus componentes se retrasan diferencialmente dependiendo de las interacciones químicas o físicas con la fase estacionaria a medida que adelantan por la columna. El grado de retención de los componentes de la muestra depende de la naturaleza del compuesto, de la composición de la fase estacionaria y de la fase móvil. El tiempo que tarda un compuesto a ser eluido de la columna se denomina tiempo de retención y se considera una propiedad identificativa característica de un compuesto en una determinada fase móvil y estacionaria.

Disolventes HPLC Los disolventes más utilizados son: Agua Metanol Acetonitrilo El agua puede contener tampones, sales, o compuestos como el ácido trifluoroacético, que ayudan a la separación de los compuestos.

Características HPLC Selectividad Reproducibilidad Sensibilidad Rapidez

Parámetros HPLC Naturaleza de la fase estacionaria Tamaño de partícula Eluyente (composición y flujo) Detector Tamaño de poro Presión de la bomba

TIPOS DE HPLC Fase Directa: separa compuestos en base a su polaridad. - Fase estacionaria polar - Fase móvil de baja polaridad - El compuesto de interés a analizar es muy polar Fase Reversa: - Fase estacionaria de polaridad baja - Fase móvil de polaridad alta - El compuesto de interés a analizar es apolar

TIPOS DE HPLC Exclusión molecular ò filtración en gel Separa las partículas de la muestra en función de su tamaño. Útil para la determinación de la estructura terciaria y la estructura cuaternaria de las proteínas purificadas. Intercambio iónico La retención se basa en la atracción electrostática entre los iones en solución y las cargas inmovilizadas a la fase estacionaria. Los iones de la misma carga son excluidos mientras que los de carga opuesta son retenidos por la columna.

Tipos de HPLC Bioafinidad Se basa en la capacidad de las sustancias biológicamente activas de formar complejos estables, específicos y reversibles. La formación de estos complejos implica la participación de fuerzas moleculares entre las partículas de la muestra y la fase estacionaria.

Mecanismos de interacción en HPLC Adsorción superficial Partición Intercambio iónico Exclusión molecular

ADSORCIÓN SUPERFICIAL La fase estacionaria es sólida. La separación se logra por las diferencias en solubilidad (en fase móvil) y de retención por adsorción (en fase estacionaria) de la mezcla de solutos.

ADSORCIÓN SUPERFICIAL Fases estacionarias más comunes: sílica y alúmina. Tanto las moléculas de solutos como de disolvente son atraídas hacia los lugares activos polares de la fase estacionaria. Unos solutos serán más atraídos que otros por la fase estacionaria y así se logrará su migración diferencial.Se usan mezclas de disolventes para conseguir el poder de elución y la selectividad adecuadas. Normalmente un disolvente apolar (n-hexano) unido a otro más activo (acetona, cloruro de metilo, etc).

PARTICIÓN La separación se basa en el reparto o distribución de los solutos entre una fase móvil líquida y otra estacionaria inmiscible, soportada sobre un sólido inerte. La discriminación se produce por diferencias de solubilidad. Las especies más retenidas serán las que presenten mayor afinidad (solubilidad) por la fase estacionaria que por la fase móvil (eluyente).

PARTICIÓN Existen dos modos básicos de operación: - Fase normal: Cuando se trabaja con fase estacionaria polar y fase móvil no polar. - Fase reversa: Cuando se emplea una fase estacionaria no polar y fase móvil polar.

FASE MÓVIL Si es un gas: Modalidad cromatográfica gaseosa. Si es un líquido: Cromatografía líquida. Cromatografía en capa delgada. Cromatografía líquida en columna abierta HPLC.

Alta pureza (calidad HPLC). Inactividad frente a la fase estacionaria Alta pureza (calidad HPLC). Inactividad frente a la fase estacionaria. Baja viscosidad. Compatibles con la muestra. Facilitar la recuperación de la muestra. Compatibilidad con el sistema de detección. Según su composición varíe o no con el tiempo: Elución isocrática Elución en gradiente

Cromatografía de partición Existen dos modos básicos de operación: Fase normal. Cuando se trabaja con fase estacionaria polar y fase móvil no polar. Fase reversa. Cuando se emplea una fase estacionaria no polar y fase móvil polar. Inicialmente tuvo más auge la fase normal pero en la actualidad son más comunes los métodos cromatográficos en fase reversa dada la naturaleza hidrofílica delas muestras de mayor interés (clínico, contaminación, alimentos).

Según empleemos fase directa o fase reversa se nos va a alterar el orden de elución de bandas y el tiempo de análisis. Materiales comerciales empleados como soportes en cromatografía de adsorción y partición.

Principales fases moviles en HPLC

SISTEMAS DE INYECCIÓN Se emplean válvulas inyectoras de volumen (loop) constante. Pueden ser manuales o automáticas. Para variar el volumen de inyección se debe cambiar el “loop” correspondiente. Se debe evitar la entrada de burbujas en el sistema de inyección.

COLUMNA Las columnas constan de: -Cuerpo – Normalmente de acero inoxidable 316 con diámetro interno de 2.6 a 3 mm o 4.6 a 5 mm. -Relleno – El material de relleno de una columna está constituido por partículas, definidas por una serie de características. (morfología, tamaño, porosidad, estructura química) Al disminuir el tamaño del relleno aumenta la eficiencia pero también la presión de trabajo.

DETECTORES Se pueden clasificar en: Detectores que miden una propiedad de la fase móvil. (Detector de Indice de Refracción) Detectores que miden una propiedad de los solutos. (Detector de Fluorescencia, Detector Ultravioleta ) Cualquier propiedad física o química que se pueda medir en la disolución podría usarse como método de detección. Los detectores en HPLC no son destructivos

Principales detectores empleados en HPLC UV/Vis Fotodiodos Índice de refracción Fluorescencia Conductividad Dispersión de luz Espectrometría de masas

FUNCIONAMIENTO DE DETECTORES DE ÍNDICE DE REFRACCIÓN El disolvente pasa a través de la mitad de una cubeta y el efluente de la columna pasa por la otra mitad Los dos compartimentos están separados por una placa de vidrio montada a un ángulo tal que si las dos disoluciones difieren en índice de refracción se produce una desviación del haz incidente.

DETECTOR DE FLUORESCENCIA Para analitos fluorescentes por naturaleza o derivados fluorescentes. Son de alta sensibilidad. No se ven interferidos por los disolventes al no tener éstos naturaleza fluorescente

DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD Son detectores basados en una respuesta diferencial y no absoluta. Empleados fundamentalmente en cromatografía de intercambio iónico. Inconvenientes: Baja sensibilidad Sensibles a impurezas de la fase móvil.

DIAGRAMA DEL DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD Cuando los iones se mueven en la celda del sensor, la impedancia eléctrica entre los electrodos cambia "fuera de la señal de equilibrio“. Desde el puente se alimenta a un circuito electrónico adecuado.

DETECTOR DE DISPERSIÓN DE LUZ Válido para aquellos solutos que sean claramente menos volátiles que la fase móvil. El eluyente es evaporado con una corriente de N2 dejando una nube de finas partículas sólidas que entran en la zona de detección. Las partículas se detectan por la luz que procede de un diodo láser y llega al fotodetector por dispersión. Sólo tampones volátiles en la fase móvil.

DIAGRAMA DEL DETECTOR DE DISPERSIÓN DE LUZ Se utiliza un spray que continuamente atomiza el eluyente de la columna en pequeñas gotas. Estas gotas se deja evaporar, dejando los solutos como las partículas finas suspendidas en el gas de atomización.

APLICACIONES DEL METODO HPLC La HPLC es particularmente útil para la separación de materiales con grandes pesos moleculares que presentan una volatilidad muy baja y no pueden separarse mediante cromatografía de gases. Se usa principalmente en la biotecnología, en ciencias y la industria farmacéutica.  La HPLC utiliza una fase móvil líquida para separar los componentes de la muestra. Los componentes se disuelven en un disolvente y a continuación se hacen pasar por la columna a una gran presión. A continuación, interactúan con la fase estacionaria y salen en momentos distintos, igual que ocurre con la cromatografía de gases.

Determinación por cromatografía Liquida (HPLC) el contenido de ácido fólico y hierro en una bebida láctea fermentada tipo yogurt enriquecida a partir de materias primas naturales. Se desarrollo una metodología para cuantificar Hierro en soja y acido fólico en el melón, soya y lentejas, ya que contienen gran cantidad de dicha vitamina según literatura, para luego adicionar al yogurt el porcentaje de hierro y acido fólico que una madre gestante necesita. El hierro se determinó por método gravimétrico y por absorción atómica. Se comparo la extracción de la vitamina por tres métodos: agitación magnética, ultrasonido y radiación de microondas.

Determinación por cromatografía Liquida (HPLC) el contenido de ácido fólico y hierro en una bebida láctea fermentada tipo yogurt enriquecida a partir de materias primas naturales. Las muestras para ácido fólico se analizaron por HPLC en fase reversa en un cromatógrafo liquido Agilent 1100, a partir de un estándar con acido fólico (MERCK 98%). Las extracciones se llevaron a cabo por triplicado para evaluar la precisión del método. Como resultado se obtuvo que la soya tiene mayor concentración de ácido fólico con relación al melón y las lentejas, el cual se adicionó al yogurt y se determinó su cantidad por el análisis ya mencionado.

CONCLUSION Se desarrollo un método Cromatográfico adecuado para la cuantificación de acido fólico en yogurt y extractos vegetales. Se obtiene mayor concentración de acido fólico a partir de yogurt aplicando el método de extracción por ultrasonido. La extracción con solución alcalina (KOH 0.1 mol/L), con agitación ultrasonido por 10 minutos, se presenta como una alternativa adecuada de determinación de ácido fólico en yogurt con soya.

CONCLUSION El patrón de ácido fólico se mantiene estable por 30 días en solución de tampón fosfato (pH 6.5) a temperatura de refrigeración (4ºC). No obstante se sugiere un estudio multivariado más rígido sobre la estabilidad del ácido fólico. La soya es una buena fuente natural de Hierro y ácido fólico y se puede emplear para producir un yogurt enriquecido con estos compuestos teniendo en cuenta la norma NTC 2457. El yogurt con adición de Hierro y soya elaborado es una buena alternativa para las madres gestantes que necesitan contrarrestar la deficiencia de acido fólico, ya que contiene los microgramos necesarios para su dieta.