DIPEPTIDYLPEPTIDASE IV AND PAPAIN IMMOBILIZATION ON FORMYL AND GLYOXYL-CELLULOSE MEMBRANES FOR PROTEASE INHIBITORS PURIFICATION BY BIOAFFINITY INTERACTION. Alberto del Monte 1, Mae Chappé 1, Lázara Romero 1, Jorge González-Bacerio 1, Dayrom Francisco Gil 1, Bessy Cutiño 1, Isel Pascual 1, Maya Chávez 1, José Manuel Guisán 2, Joaquín Díaz 1. 1 Centro de Estudio de Proteínas, Facultad de Biología, Universidad de La Habana, La Habana, Cuba. 2 Instituto de Catálisis y Petroleoquímica, CSIC, Madrid, España. ABSTRACT The search of proteases inhibitors has become a broad field where strategies are approached that goes from the “in silico” rational design of new molecules until the search for bioactive compound in natural sources. This last subject requires the design of purification protocols simple, economic and highly efficient; therefore, every time is more frequent the employment of affinity chromatography as crucial stage in the purification of molecules of natural origin. This study describes the methodology to immobilize the cystein protease papain and the serine protease dipeptidylpeptidase IV (DPP IV) in formyl-cellulose (formyl-Cell) and Glyoxyl-cellulose (Glyoxyl-Cell) membranes. The membranes of cellulose acetate (pore size 0.45 μm, diameter 47 mm) were deacetyladed and oxidized for two different methodologies: i) oxidation with sodium periodate (formyl groups generation) and ii) etherification with glycidol and oxidation with sodium periodate (Glyoxyl groups generation). The oxidation grade for formyl- and Glyoxyl-Cell membranes was 4.85 and µmoles aldehydes/cm2 surface, respectively. The methodology of rational design developed in our group was applied to determine the enzyme load. The Differential Immobilization Degree for the derivatives papain-Cell, papain-ethyloxi-Cell, DPP IV-Cell and DPP IV-ethyloxi-Cell were: 1.96, 2.28, 0.42 and 0.99 UAE/ cm2 surface respectively. The inhibitors Cystatin (for Papain) and Bacitracin (for DPP IV) were employed to estimate the Absolute Dynamic Capacity (ADC) of each immobilized derivatives. ADC for papain-Cell, papain-ethyloxi-Cell, DPP IV-Cell and DPP IV-ethyloxi-Cell were: 1.35, 2.16, 4.80 and 1.10 (μg inhibitor)/(cm2 of surface), respectively. The results of this work validate these immobilized derivatives for its use in purification by affinity chromatography.. CYTED: Red ENZNUT (108RT0346). INFORMATICA ddmm Srl, Bergamo. Italy Acetato de CelulosaProteína-CelulosaOCOCH3 1) 2) 3) 4) 1)Desacetilación del soporte Acetato de Celulosa. 2)Obtención del soporte de formil-Celulosa. 3) Inmovilización de la proteína por los residuos amino disponibles. 4) Reducción de la base de Schiff. Acetato de CelulosaProteína-etiloxi-Celulosa 1) 2) 3) 4) 5) OCOCH3 1)Desacetilación del soporte Acetato de Celulosa. 2) Obtención del soporte de Gliceril-Celulosa. 3)Generación del soporte Glioxil-Celulosa por oxidación. 4)Inmovilización de la proteína por los residuos amino disponibles. 5)Reducción de la base de Schiff. Unidad estructural del diacetato de celulosa.. Reacción con el reactivo de Schiff (Fairbanks et al., 1971) Revelado del soporte formil-Celulosa. 1- Acetato de celulosa, 2- Acetato de celulosa hidratada, 3- Celulosa regenerada 4- formil-Celulosa. Revelado del soporte glioxil-Celulosa. 1- Acetato de celulosa, 2- Acetato de celulosa hidratada, 3- Celulosa regenerada 4- glioxil-Celulosa. Determinación cualitativa de la oxidación de las membranas Determinación cuantitativa de la oxidación de las membranas Estimación de los µmoles CHO /cm 2 de membrana generados mediante la determinación de los µmoles de NaIO 4 consumidos. ~ 2 veces Optimización de las condiciones de la reacción de eterificación con Glicidol para la obtención de las membranas glioxil-Celulosa Tiempo [NaOH] Reacción con el reactivo de Brady (2,4 DNF) (Moreno, 2007) Reacción con el reactivo de Schiff (Fairbanks et al., 1971) Modificación del método informado por Guisán, JM para soportes sólidos porosos esféricos base Sepharose (glioxil-Sepharose). Degradación mecánica de las membranas glioxil-Celulosa CMT (µg/cm 2 ) ± ± 0.005DPP IV-etiloxi-Celulosa ± ± 0.007DPP IV-Celulosa ± ± 0.036Papaína-etiloxi-Celulosa ± ± 0.047Papaína-Celulosa % I GI diferencial (µg/cm 2 ) Carga (µg/cm 2 ) Derivado Inmovilizado ± ± ± 0.058DPP IV-etiloxi-Celulosa ± ± ± 0.007DPP IV-Celulosa ± ± ± 0.103Papaína-etiloxi-Celulosa ± ± ± 0.077Papaína-Celulosa % RAF GI directo (U/cm 2 ) % I GI diferencial (U/cm 2 ) Carga (U/cm 2 ) Derivado Inmovilizado Parámetros de Control del Proceso de Inmovilización Parámetros de Control del Proceso de Inmovilización en función de la Cantidad de Poteina para los derivados inmovilizados papaína-Celulosa, papaína etiloxi- Celulosa, DPP IV-Celulosa y DPP IV-etiloxi-Celulosa. Parámetros de Control del Proceso de Inmovilización en función de la Actividad Enzimática para los derivados inmovilizados papaína-Celulosa, papaína etiloxi- Celulosa, DPP IV-Celulosa y DPP IV-etiloxi-Celulosa Papaína-etiloxi-Celulosa Papaína-Celulosa x DPP IV-etiloxi-Celulosa x DPP IV-Celulosa CDA (µg Efector/cm 2 ) Derivado Inmovilizado Valores de CDA para los derivados inmovilizados papaína-celulosa, papaína- etiloxi-celulosa, DPP-IV-celulosa y DPP- etiloxi-celulosa. Determinación de la capacidad de absorción bioespecífica de efector para los derivados inmovilizados papaína- Celulosa y papaína-etiloxi-Celulosa en base a la cantidad de efector añadido. Determinación de la capacidad de absorción bioespecífica de efector para los derivados inmovilizados DPP IV- Celulosa y DPP IV-etiloxi-Celulosa en base a la cantidad de efector añadido. Cistatina Bacitracina Efector Las dos metodologías utilizadas para la oxidación y activación de las membranas posibilitan la oxidación de estas, no obstante el derivado glioxil celulosa presentó un grado de oxidación muy superior al del derivado formil celulosa. Mediante la inmovilización covalente por grupos amino a partir de las membranas de acetato de celulosa previamente activadas, es posible inmovilizar las proteasas papaína y DPP IV con parámetros de inmovilización adecuados. El derivado glioxil celulosa resultó el de mejores resultados en términos de GI y %I tanto para proteína fijada como para actividad funcional en el caso de Papaína mientras que para DPP IV ambos derivados muestran resultados satisfactorios. Los experimentos de adsorción y capacidad realizados con los inhibidores de ambas enzimas mostraron la capacidad de los soportes obtenidos de enlazar estas moléculas, lo que posibilita el uso de estos en cromatografía de afinidad. El experimento de capacidad permitió determinar la CDA la cual demostró ser superior en los soportes obtenidos por eterificación del glicidol. Además se demostró la validez de estos soportes para su uso en cromatografía de afinidad. CONCLUDING REMARKS ACKNOWLEDGEMENTS: