CONTROL DE LA BIOCONTAMINACIÓN EN AMBIENTES CLASIFICADOS Antonio Rodríguez Acosta Facultativo Especialista Análisis Clínicos Responsable de Calidad Unidad de Producción Celular HRU Carlos Haya (Málaga) COLABORADOR ASESORÍA TÉCNICA GRADOCELL

Iniciativa Andaluza de Terapias Avanzadas Plan general de control ambiental Métodos de muestreo

con las terapias avanzadas Impulsar el desarrollo y la traslación clínica de nuevas terapias basadas en los resultados de los 3 programas de investigación relacionados con las terapias avanzadas PROGRAMA ANDALUZ DE NANOMEDICINA PROGRAMA ANDALUZ DE TERAPIA CELULAR Y MEDICINA REGENERATIVA PROGRAMA ANDALUZ DE GENÉTICA CLÍNICA Y MEDICINA GENÓMICA 3

Laboratorios GMP Públicos de Terapia Celular en ANDALUCÍA UBICADOS EN CENTROS DE INVESTIGACIÓN: CABIMER: acreditado. LABORATORIO ANDALUZ DE REPROGRAMACIÓN CELULAR: en validación. UBICADOS EN HOSPITALES: Hospital Virgen de las Nieves: acreditado. Hospital Reina Sofía: acreditado. Hospital Carlos Haya : en validación. UBICADOS EN BANCOS DE TEJIDOS: Banco de Tejidos de Málaga: acreditado. Banco de Tejidos de Granada: en validación. Banco de Tejidos de Sevilla: en validación. Banco de Tejidos de Córdoba: en validación.

Plan General de Control Ambiental Los medicamentos basados en terapia celular han de fabricarse mediante “procesamiento aséptico”, por esta razón la carga microbiana del ambiente de fabricación es un factor importante para garantizar un adecuado nivel de esterilidad para los productos fabricados.

CONTROL DE LA BIOCONTAMINACIÓN Plan general de actuación Medicamentos usados en terapia celular: “fabricación aséptica” (media- fill): carga microbiana del ambiente de fabricación: clave para garantizar la esterilidad de los productos fabricados. Biocontaminación: contaminación de materiales, equipos, superficies, líquidos y gases con partículas viables. Control de la biocontaminación: establecer principios y metodología para controlar los niveles de contaminación microbiológica. definir las medidas de control adecuadas para disminuir el riesgo de contaminación. Los medicamentos basados en terapia celular han de fabricarse mediante “procesamiento aséptico”, por esta razón la carga microbiana del ambiente de fabricación es un factor importante para garantizar un adecuado nivel de esterilidad para los productos fabricados.

Plan general de actuación Principales vías de entrada de microorganismos a las instalaciones: Personal: Partículas generadas por la descamación de la piel: personal de producción/control de calidad; operarios de mantenimiento de instalaciones; personal implicado en la cualificación de equipos; operarios de limpieza. Comportamiento en el área clasificada Materiales: introducción de materiales y reactivos; introducción de equipos/instrumentos; actuaciones de mantenimiento en la instalación (sustitución de elementos). FORMACIÓN

Plan general de actuación Procedimientos que pueden afectar al nivel de biocontaminación entrada de personal y vestuario; introducción de materiales; limpieza y desinfección de instalaciones y equipos; métodos de control microbiológico del área clasificada.

Control microbiológico Principios generales Control microbiológico identificación de riesgos para el producto; probabilidad de que éstos ocurran; medidas de prevención y control; designación de las zonas de riesgo, determinación de los puntos y procedimientos de muestreo; establecimiento de límites que aseguren el control microbiológico (niveles de alerta y acción); medidas correctoras a realizar cuando se superen los niveles de alerta y acción. PLAN GENERAL DE CONTROL MICROBIOLÓGICO: identificación de los potenciales riesgos para el producto, probabilidad de que éstos ocurran e identificación de las medidas para su prevención y control; designación de las zonas de riesgo, determinación de los puntos y procedimientos de muestreo con el fin de eliminar el riesgo o disminuir la probabilidad de que ocurra; establecimiento de límites que aseguren el control microbiológico (niveles de alerta y acción); establecimiento de un programa de control; medidas correctoras a realizar cuando se superen los niveles de alerta y acción.

Niveles de alerta y acción Principios generales. Durante la puesta a punto de la instalación (condición “en reposo”) se establecerá un NIVEL BASAL DE CONTAMINACIÓN que posteriormente ha de ser monitorizado “en funcionamiento” con el fin de detectar aumentos en los niveles de contaminación. Niveles de alerta y acción Nivel de “alerta”: ESTABLECIDO POR EL USUARIO; proporciona una alarma temprana ante el desvío de las condiciones normales; implica un aumento de la atención sobre el proceso. Nivel de “acción”: (ESTABLECIDO POR EL USUARIO); requiere intervención inmediata; investigación de la causa; establecimiento de medidas correctoras. Nivel de “alerta”: nivel de contaminación ESTABLECIDO POR EL USUARIO y que proporciona una alarma temprana sobre el desvío de las condiciones normales. Implica un aumento de la atención sobre el proceso. Nivel de “acción”: nivel de contaminación ESTABLECIDO POR EL USUARIO, el cual, una vez superado, requiere de una intervención inmediata, investigación de la causa y el establecimiento de medidas correctoras.

Metodología general control microbiológico Muestreo, incubación, recuento e identificación si procede de partículas viables mediante: métodos adecuados; plan de muestreo preestablecido (puntos y frecuencia). Minimizar el riesgo de contaminación debido a los propios métodos de muestreo. Preferible muestrear con la instalación “en funcionamiento” (equipos y personal realizando operaciones habituales). No debe comprometerse de ninguna manera las operaciones de fabricación ni poner en riesgo la calidad del producto. Las condiciones de muestreo (ej: número de operarios en la zona) deben quedar registradas o trazadas. Control de biocontaminación: ha de realizarse mediante el muestreo, incubación y recuento de partículas viables mediante métodos adecuados y de acuerdo con un plan de muestreo preestablecido (puntos y frecuencia). PROCESOS DE MUESTREO: han de diseñarse e implantarse de forma que se minimice el riesgo de contaminación debido a los propios métodos de muestreo.

Frecuencia de muestreo Ha de estar previamente establecida (ej: semanal y mensual) y revisarse según sea necesario en los siguientes casos: superación reiterada de los niveles de alerta o de acción; paradas prolongadas de las instalaciones; realización de trabajos de mantenimiento importantes en los sistemas de ventilación; obtención de resultados inusuales; cambios en los procedimientos de limpieza o desinfección; acontecimientos inesperados que puedan favorecer la biocontaminación.

Identificación de las muestras Mantener la trazabilidad con la siguiente información: punto de muestreo; fecha y hora; personal que realiza el muestreo; actividad realizada en la sala durante el muestreo; lote y medio de cultivo usado; equipos utilizados para el muestreo e incubación; desviaciones sobre el plan de muestreo.

Procesamiento de muestras. Medios de cultivo. Condiciones de incubación No selectivos: capaces de soportar el crecimiento de una amplia variedad de microorganismos; medios con base tripticasa de soja son ampliamente aceptados (TSA y TSB). Garantizar la calidad de los medios empleados: especificaciones; certificados de análisis. Demostrar crecimiento según condiciones de incubación establecidas en cada Unidad: ensayos de promoción de crecimiento. según microorganismos esperados.

Procesamiento de muestras. Condiciones de incubación. 2-5 días (30-35 ºC) bacterias; 5-7 días (20-25 ºC) hongos y levaduras Generalmente aceptados cuando el número de partículas viables es pequeño. Otras condiciones de incubación: siempre y cuando se demuestre que proporcionan el ambiente adecuado para promover el crecimiento de los microorganismos presentes en la instalación. Sospecha microorganismos con necesidades exigentes de crecimiento: medios de cultivo, períodos y condiciones de incubación adecuados. Control de estufas: las condiciones de incubación han estar monitorizadas. Observación periódica de las placas durante la incubación. Cuando se sospeche la presencia de bacterias anaerobias, termófilas (>45ºC), microaerófilas u otro tipo de microorganismos con necesidades exigentes de crecimiento, se han de utilizar medios de cultivo, períodos y condiciones de incubación adecuados. Control de estufas: las condiciones de incubación han estar monitorizadas de forma que se asegure que la temperatura de incubación adecuada se mantiene a lo largo de todo el período de incubación.

Recuento e Identificación de microorganismos aislados El nivel de caracterización dependerá de la criticidad del área clasificada: morfología celular mediante tinción de Gram (ej, áreas no críticas); identificación a nivel de género y especie (áreas críticas). Los identificaciones obtenidas pueden ayudar a: evaluar procesos de limpieza y desinfección implantados (aparición de resistencias); identificar las posibles fuentes de contaminación. Si los resultados indican: superación de los límites establecidos; cambio en el estatus microbiológico de la instalación. ACCIONES CORRECTIVAS

Métodos de control microbiológico

Métodos de control microbiológico Niveles de control : aire: muestreo pasivo: sedimentación de partículas viables; muestreo activo: volumétrico de aire por impacto de partículas viables en medios sólidos; superficies; (vestimenta); (líquidos).

Sedimentación de partículas viables. Microorganismos en ambiente: transportados por partículas de diferentes tamaños provenientes principalmente de: descamación de piel humana; aerosoles (saliva) ; polvo. El tamaño de partícula determina la velocidad de sedimentación (media 0.46 cm/s, puede variar entre 0.2 y 3 cm/s* ) Medida de la sedimentación de partículas viables sobre las superficies Valoración directa de la probabilidad de contaminación del producto. Los microorganismos presentes en el ambiente son transportados por partículas de diferentes tamaños provenientes principalmente de la descamación de la piel humana, pequeñas gotas de saliva y polvo. La variedad de los tamaños de partículas determina la velocidad de sedimentación de los microorganismos en las superficies. La velocidad media de deposición de partículas se establece en 0.46 cm/s pero suele oscilar entre 0.2 y 3 cm/s* dependiendo del tamaño de las mismas. Proporciona una medida de la sedimentación de partículas viables sobre las superficies y por tanto una valoración directa de la probabilidad de contaminación del producto. Por ello, dos ambientes pueden tener el mismo recuento total de partículas viables en aire (muestreo volumétrico) pero poseer diferentes probabilidades de contaminación del producto. *W. Whyte and NDS Bell, “The prediction of airborne contamination of aseptically filled containers: a case study”

Sedimentación de partículas viables. Límites de aceptación (Anexo I, NCF): Placas de 90 mm de diámetro (64 cm2). Deshidratación del medio por exposición al ambiente: reducción en la viabilidad de los microorganismos (máxima exposición 4 horas). La contaminación del producto mediante partículas viables presentes en el ambiente es directamente proporcional a: área de la “boca” de los contenedores (ej, flask de cultivo); tiempo en que los contenedores están abiertos (tiempo de exposición); calidad microbiológica del aire. GRADO Ufc /placa de 90 mm diámetro. A < 1 B 5 C 50 D 100 El tamaño recomendado placas: 90 mm de diámetro (64 cm2). La deshidratación del medio de cultivo por exposición al ambiente puede provocar una reducción en la viabilidad de los microorganismos y por tanto en los recuentos obtenidos. Esto puede ocurrir en aquellas placas preparadas con poca cantidad de medio. La contaminación del producto mediante partículas viables presentes en el ambiente es directamente proporcional a: área de la “boca” de los contenedores (ej, flask de cultivo); tiempo en que los contenedores están abiertos (tiempo de exposición); calidad microbiológica del aire.

Sedimentación de partículas viables. Relacionando el área y tiempo de exposición del producto y placas de sedimentación se puede calcular la probabilidad de contaminación del producto:

Sedimentación de partículas viables. Ventajas: económico; monitorización de procesos: pueden colocarse muy próximas al área donde el producto está expuesto; no interfiere con el flujo de aire de la zona (monitorización en CFL, grado A); riesgo bajo para la calidad del producto y la esterilidad del proceso; no es necesaria la participación de personal adicional. Inconvenientes: Debido a los bajos niveles de contaminación esperados, presenta poca sensibilidad, a menos que los períodos de muestreo sean amplios.

Muestreo volumétrico de aire Límites de aceptación (Anexo I, NCF): Recolección de partículas viables mediante un instrumento de muestreo apropiado y de acuerdo con un plan de muestreo. Estimación de la cantidad de microorganismos suspendidos en el aire y por tanto nos proporciona una medida indirecta del riesgo de contaminación del producto. Muestreador de aire: aspira e impacta (a velocidad de 11 m/s) todas las partículas de tamaño superior a 1 μm sobre una superficie de agar nutritivo (también en medios líquidos). GRADO Ufc permitidas/m3 A < 1 B 10 C 100 D 200

Muestreo volumétrico de aire Volumen a muestrear: 1 m3. Tamaño recomendado de las placas usadas: 90 mm de diámetro (64 cm2). Corrección estadística de FELLER: a mayor cantidad de microorganismos, mayor probabilidad de que penetren varios microorganismos por el mismo orificio de la tapa y se solapen las ufc que aparecen tras incubación. Muestrear desde las zonas de mayor a las de menor grado. Aseptizar/esterilizar el cabezal antes de una jornada de muestreo.

Control microbiológico de superficies Límites de aceptación (Anexo I, NCF): Objetivo: determinar la eficacia de los procedimientos de limpieza rutinarios Fuentes de contaminación de superficies: sedimentación de partículas viables. contacto directo con el operador. Los medios usados han de poseer agentes neutralizantes que inactiven los residuos de los productos de limpieza usados: GRADO Ufc /placa 55 mm A < 1 B 5 C 25 D 50 Desinfectante Neutralizante Fenólicos Polisorbato 80 (Tween 80) Clorados Tiosulfato sódico Iodados Compuestos de amonio cuaternario Lecitina + Tween 80 Peróxido de hidrógeno Piruvato sódico, catalasa

Control microbiológico de superficies Muestreo con placas de contacto Se aplica un medio nutritivo sólido sobre una superficie de área conocida. Placas de 55 mm de diámetro (25 cm2) tipo RODAC (Replicate Organisms Detection And Counting). Las ufc obtenidas son una imagen de los microorganismos presentes en el área analizada. El medio nutritivo ha de estar en contacto con la superficie durante unos segundos, ejerciendo una presión uniforme en toda la placa y en ausencia de movimientos. Limpiar cuidadosamente con solución desinfectante (alcohol 70%) y toallita estéril el área muestreada con el fin de eliminar los restos de medio de cultivo.

Control microbiológico de superficies Muestreo con hisopos Hisopos previamente humedecidos: muestreo de zonas irregulares o inaccesibles a las placas de contacto. Se han de realizar trazadas paralelas por la superficie que se desea analizar. Posteriormente se repite la operación en el mismo área y con el mismo hisopo pero con trazadas perpendiculares a las anteriores. El hisopo al mismo tiempo ha de rotarse. Posteriormente el hisopo se introduce en medio líquido y agita. Se realiza una siembra e incubación de este medio líquido en placas de medio sólido. Hisopos previamente humedecidos: para muestrear aquellas zonas irregulares o inaccesibles a las placas de contacto. Se han de realizar trazadas paralelas por la superficie que se desea analizar. Posteriormente se repite la operación en el mismo área y con el mismo hisopo pero con trazadas perpendiculares a las anteriores. El hisopo al mismo tiempo ha de rotarse. Posteriormente el hisopo se introduce en medio líquido y agita. Se realiza una siembra e incubación de este medio líquido en placas de medio sólido.

Principales fuentes de biocontaminación Microorganismo Estado Principales fuentes de contaminación Cocos gram + (Micrococos) Formas vegetativas. Partículas de descamación de la piel y aerosoles (tos). Staphylococcus Pelo, piel, heridas, abscesos, ropa y polvo. Bacillus Esporas Aire, polvo, cartón, papel, agua y ropa. Hongos filamentosos Suelo, polvo, cartón y papel. Levaduras Pelo y piel.

Conclusiones La función principal de la monitorización microbiológica es identificar tendencias que sugieran una pérdida del control ambiental. Medidas para contener la contaminación: Entrenamiento y formación del personal. Evitar acceso de personal no autorizado. Mantener en adecuado estado las instalaciones (filtros, temperatura, humedad, presiones). Correctas medidas de desinfección de materiales. Adecuado sistema de entrada y vestimenta del personal. Eficaz sistema de limpieza (personal entrenado y desinfectantes adecuados).

Bibliografía ISO 14644: Cleanrooms and controlled environments: Part 1:Classsification of air cleanliness Part 2: Specifications for testing and monitoring ISO 14648: Cleanrooms and associated controlled environments. Biocontaminacion control: Part 1: General principles and methods. Part 2: Evaluation and interpretation of biocontamination data. Guidelines on test methods for environmental monitoring for aseptic dispensing facilities. Second edition. Garcia, Lynne S. (2010). Clinical Microbiology Procedures Handbook, Volumes 1-3 (3rd Edition). American Society for Microbiology (ASM). (http://www.knovel.com/web/portal/browse/display?_EXT_KNOVEL_DISPLAY_bookid=4194&VerticalID=0) WHYTE, W. In support of settle plates. PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology, 50, pp. 201-204, 1996 Evaluation of Irradiated Count-Tact 3P Performances bioMérieux Industry Culture Media Group, Chemin de l’Orme, 69280 Marcy l’Etoile, France.