Small Angle X-ray Scattering http://imaisd.usc.es/riaidt/raiosx/ Universidade de Santiago de Compostela Servizo de difracción de RaiosX ED. CACTUS Campus sur Aplicaciones de la técnica SAXS (Small Angle X-ray Scattering) Aplicaciones de la técnica SAXS Small Angle X-ray Scattering

Aplicaciones de la técnica SAXS http://imaisd.usc.es/riaidt/raiosx/ Universidade de Santiago de Compostela Servizo de difracción de RaiosX ED. CACTUS Campus sur Aplicaciones de la técnica SAXS (Small Angle X-ray Scattering) q I

DIFERENCIAS ENTRE SAXS Y DIFRACCIÓN RX NO necesitamos sistemas sólidos http://imaisd.usc.es/riaidt/raiosx/ Universidade de Santiago de Compostela Servizo de difracción de RaiosX ED. CACTUS Campus sur Aplicaciones de la técnica SAXS (Small Angle X-ray Scattering) DIFERENCIAS ENTRE SAXS Y DIFRACCIÓN RX NO necesitamos sistemas sólidos No necesitamos Cristalizar Cristales líquidos formación de nanopartículas Medidas Dinámicas DIAGNOSIS DE CANCER DE MAMA Polimeros, Micelas Partículas, Nanopartículas Diagnóstico de Cancer Posibilidad de determinar la estructura de macromoléculas biológicas pero en su medio natural

Procedimiento Experimental http://imaisd.usc.es/riaidt/raiosx/ Universidade de Santiago de Compostela Servizo de difracción de RaiosX ED. CACTUS Campus sur Aplicaciones de la técnica SAXS (Small Angle X-ray Scattering) Procedimiento Experimental Sustracción del blanco Promediado de las diferentes recogidas Técnica de contraste Solvente Muestra

Aplicaciones de la técnica SAXS http://imaisd.usc.es/riaidt/raiosx/ Universidade de Santiago de Compostela Servizo de difracción de RaiosX ED. CACTUS Campus sur Aplicaciones de la técnica SAXS (Small Angle X-ray Scattering) EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN SISTEMAS MONODISPERSOS I/c q Un aumento de la concentración inplica una disminución de la I a bajos ángulos debido a las interacciones entre partículas q Sistemas no interaccionantes

ESPACIO RECIPROCO – ESPACIO REAL http://imaisd.usc.es/riaidt/raiosx/ Universidade de Santiago de Compostela Servizo de difracción de RaiosX ED. CACTUS Campus sur Aplicaciones de la técnica SAXS (Small Angle X-ray Scattering) ESPACIO RECIPROCO – ESPACIO REAL La Curva de Scattering muestra la información del espacio recíproco Función de Scattering Función de distribución de pares La Pr muestra la información del espacio Real

Aplicaciones de la técnica SAXS http://imaisd.usc.es/riaidt/raiosx/ Universidade de Santiago de Compostela Servizo de difracción de RaiosX ED. CACTUS Campus sur Aplicaciones de la técnica SAXS (Small Angle X-ray Scattering) PARTÍCULAS ESFÉRICAS Presentan un máximo a Dmax/2 PARTÍCULAS CILÍNDRICAS Presentan un máximo a menores distancias correspondientes al radio de la sección transversal FACTOR DE FORMA PARTÍCULAS DE MÚLTIPLES UNIDADES Persentan múltiples máximos en función de las distancias intra_subunidades y entre unidades

Aplicaciones de la técnica SAXS http://imaisd.usc.es/riaidt/raiosx/ Universidade de Santiago de Compostela Servizo de difracción de RaiosX ED. CACTUS Campus sur Aplicaciones de la técnica SAXS (Small Angle X-ray Scattering) ¿PORQUÉ SAXS PARA MACROMOLÉCULAS? Posibilidad de obtener parámetros moleculares de forma sencilla: 1- Radio de Giro 2- Peso Molecular 3- Volumen Datos a Baja Resolución 4- Grado de Hidratación 5- Forma Posibilidad de construir modelos atómicos de la estructura Datos a Alta Resolución + ayuda otras técnicas

INFORMACIÓN ESTRUCTURAL EN MOLÉCULAS BIOLÓGICAS http://imaisd.usc.es/riaidt/raiosx/ Universidade de Santiago de Compostela Servizo de difracción de RaiosX ED. CACTUS Campus sur Aplicaciones de la técnica SAXS (Small Angle X-ray Scattering) INFORMACIÓN ESTRUCTURAL EN MOLÉCULAS BIOLÓGICAS Grigoryev en 1971 encontró tanto en polipéptidos sintéticos como en naturales que se puede determinar de forma sencilla si se trata de una estructura β o de una hélice α puesto que ambas presentan un máximo característico en las curvas de SAXS. Helice α Estructura β ESTRUCTURA SECUNDARIA

Métodos de Ensayo-Error http://imaisd.usc.es/riaidt/raiosx/ Universidade de Santiago de Compostela Servizo de difracción de RaiosX ED. CACTUS Campus sur Aplicaciones de la técnica SAXS (Small Angle X-ray Scattering) Svergun, D.I., Petoukhov,M.V. & Koch, M.H.J. (2001) Biophys. J. 80, 2946-2953. METODOS ab initio Métodos de Ensayo-Error Es de gran utilizar para localizar fragmentos de la molécula que no se han podido determinar por otras técnicas Metodología como anterior pero con “Residuos” conocidos Se puede acotar las soluciones Se genera una esfera de diámetro Dmax Históricamente fue el primer modelo Se trata de conocer las coordenadas de estos residuos que ajusten la curva experimental Se rellena de “bolas” de radio r0 Genera un código binario: 1 si pertenece a la partícula 0 si pertenece al solvente Se fija lo conocido y se lanza el proceso de annealing para minimizar las diferencias Simulando un proceso de annealing donde se incluye un factor de penalización que asegure una forma compacta y conectada Número pequeño de parámetros Cambian criterios de compacidad por criterios de distribución espacial Datos baja resolución Determina formas con huecos en su interior Se limitaba a definir el contorno de la molécula con formas geométricas sencillas Mediante un método Monte-Carlo (aleatorio) se modifica en código para generar las curvas Stuhrmann, H. B. (1970) Z.Physik. Chem. N.F. 72,177Svergun, D.I. et al. (1996)Acta Crystallogr. A52, 419 Chacón, P. et al. (1998)Biophys. J. 74, 2760 Svergun, D.I. (1999)Biophys. J. 76, 2879

La estructura própia de la proteina (PDB) http://imaisd.usc.es/riaidt/raiosx/ Universidade de Santiago de Compostela Servizo de difracción de RaiosX ED. CACTUS Campus sur Aplicaciones de la técnica SAXS (Small Angle X-ray Scattering) MODELOS ATÓMICOS La estructura própia de la proteina (PDB) Si tenemos información adicional sobre la estructura y buenos datos experimentales podemos evaluar de forma precisa nuestro modelo estructural Si no la conocemos entera podemos mediante los fragnemtos de las misma refinar mediante sólido rígido rotaciones y traslaciones de los mismos para generar la estructura completa Volumen del solvente excluido de la partícula Pero aún así la situación no es fácil puesto que debemos de tener en cuenta: Capa de Hidratación

Aplicaciones de la técnica SAXS http://imaisd.usc.es/riaidt/raiosx/ Universidade de Santiago de Compostela Servizo de difracción de RaiosX ED. CACTUS Campus sur Aplicaciones de la técnica SAXS (Small Angle X-ray Scattering) Refinement of Multidomain Protein Structures by Combinationof Solution Small-Angle X-ray Scattering and NMR Data Alexander Grishaev,*,† Justin Wu,‡ Jill Trewhella,§ and Ad Bax*,† Contribution from the Laboratory of Chemical Physics, NIDDK, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland 20892-0520, Department of Biochemistry, The Ohio State UniVersity, Columbus, Ohio 43210, and Department of Chemistry, UniVersity of Utah, Salt Lake City, Utah 84112-0850 Received June 30, 2005; E-mail: grishaev@speck.niddk.nih.gov; bax@nih.gov Abstract:Determination of the 3D structures of multidomain proteins by solution NMR methods presentsa number of unique challenges related to their larger molecular size and the usual scarcity of constraintsat the interdomain interface, often resulting in a decrease in structural accuracy. In this respect, experimentalinformation from small-angle scattering of X-ray radiation in solution (SAXS) presents a suitable complementto the NMR data, as it provides an independent constraint on the overall molecular shape. A computationalprocedure is described that allows incorporation of such SAXS data into the mainstream high-resolutionmacromolecular structure refinement. The method is illustrated for a two-domain 177-amino-acid protein,çS crystallin, using an experimental SAXS data set fitted at resolutions from 200 Å to 30 Å. Inclusionof these data during structure refinement decreases the backbone coordinate root-mean-square differencebetween the derived model and the high-resolution crystal structure of a 54% homologous çB crystallinfrom 1.96 ( 0.07 Å to 1.31 ( 0.04 Å. Combining SAXS data with NMR restraints can be accomplished ata moderate computational expense and is expected to become useful for multidomain proteins, multimericassemblies, and tight macromolecular complexes. DRX

of Sciences, 117333 Moscow, Russia http://imaisd.usc.es/riaidt/raiosx/ Universidade de Santiago de Compostela Servizo de difracción de RaiosX ED. CACTUS Campus sur Aplicaciones de la técnica SAXS (Small Angle X-ray Scattering) Addition of Missing Loops and Domains to Protein Models by X-Ray Solution Scattering Maxim V. Petoukhov,*† Nigel A. J. Eady,‡ Katherine A. Brown,‡ and Dmitri I. Svergun*§ *European Molecular Biology Laboratory, Hamburg Outstation, D-22603 Hamburg, Germany; †Physics Department, Moscow State University, 117234 Moscow, Russia; ‡Department of Biological Sciences, Centre for Molecular Microbiology and Infection, Imperial College of Science, Technology and Medicine, London SW7 2AY, United Kingdom; and §Institute of Crystallography, Russian Academy of Sciences, 117333 Moscow, Russia ABSTRACT Inherent flexibility and conformational heterogeneity in proteins can often result in the absence of loops andeven entire domains in structures determined by x-ray crystallographic or NMR methods. X-ray solution scattering offers thepossibility of obtaining complementary information regarding the structures of these disordered protein regions. Methods arepresented for adding missing loops or domains by fixing a known structure and building the unknown regions to fit theexperimental scattering data obtained from the entire particle. Simulated annealing was used to minimize a scoring functioncontaining the discrepancy between the experimental and calculated patterns and the relevant penalty terms. In lowresolutionmodels where interface location between known and unknown parts is not available, a gas of dummy residuesrepresents the missing domain. In high-resolution models where the interface is known, loops or domains are represented asinterconnected chains (or ensembles of residues with spring forces between the C atoms), attached to known position(s) inthe available structure. Native-like folds of missing fragments can be obtained by imposing residue-specific constraints. Aftervalidation in simulated examples, the methods have been applied to add missing loops or domains to several proteins wherepartial structures were available.

SINCROTÓN LNLS (Campinas, Brasil) http://imaisd.usc.es/riaidt/raiosx/ Universidade de Santiago de Compostela Servizo de difracción de RaiosX ED. CACTUS Campus sur Aplicaciones de la técnica SAXS (Small Angle X-ray Scattering) SINCROTÓN LNLS (Campinas, Brasil)