GENOTECAS COMBINATORIALES DE ANTICUERPOS Y OTRAS ESTRATEGIAS Curso de Doctorado: Metodologías de generación y expresión de anticuerpos TEMA 6 GENOTECAS COMBINATORIALES DE ANTICUERPOS Y OTRAS ESTRATEGIAS García-Suárez MM

GENOTECAS COMBINATORIALES DE ANTICUERPOS Son repertorios de genes V murinos o humanos que han sido generadas mediante la técnica de despliegue en fagos o en bacterias. Permiten la obtención de todo tipo de anticuerpos total o parcialmente in vitro. Despliegue de anticuerpos en superficie Consiste en la expresión de anticuerpos recombinantes en la superficie de bacterias o de fagos mediante la fusión con proteínas de la cubierta. BACTERIAS FAGOS

DESPLIEGUE DE ANTICUERPOS EN FAGOS FILAMENTOSOS (PHAGE DISPLAY) FUSIÓN CON pIII. El número de copias por partícula será como máximo de 5. Admite fragmentos de mayor tamaño y permite la selección de anticuerpos de alta afinidad. scFv FUSIÓN CON HÍBRIDOS DE pVIII. Permite la expresión de insertos de mayor tamaño. El número de copias es de aprox. 100. Se necesita un fagémido y un fago helper. Pueden ocurrir efectos de avidez, por lo que se obtienen anticuerpos de menor afinidad. scFv scFv pIII VH VL gIII FUSIÓN CON pIX O CON pVII. Hay 5 copias por partícula fágica que se sitúan en el extremo opuesto a pIII. Permiten selección de anticuerpos de alta afinidad. scFv

GENERACIÓN DE GENOTECAS COMBINATORIALES DE ANTICUERPOS 1. Obtención de mRNA linfocitos. 2. Transcripción reversa. 3. Amplificación de genes V H y VL con primers específicos. 4 y 5. Clonación de la cadena ligera y la cadena pesada en un fago o un fagémido. 6. Transformación de E. coli y obtención de partículas fágicas. Infección con un fago helper si estamos utilizando un fagémido. 7. Selección y enriquecimiento en partículas fágicas portadoras de anticuerpos específicos. 8. Infección de E. coli con fagos específicos. 9. Obtención de anticuerpos solubles a partir de cultivos. CARACTERÍSTICAS FUNDAMENTALES. Tamaño de la genoteca Diversidad de genes

SELECCIÓN Y ENRIQUECIMIENTO DE ANTICUERPOS ESPECÍFICOS PANNING

OTROS MÉTODOS DE SELECCIÓN DE ANTICUERPOS ESPECÍFICOS BIOPANNING ELUCIÓN ESPECÍFICA SOBRE CÉLULAS COLUMNAS DE AFINIDAD SOBRE DOTS E INMUNOBLOTS CON CITOMETRÍA DE FLUJO CON BOLAS MAGNÉTICAS SiP IN VIVO

SIP (SELECTIVELY- INFECTIVE PHAGE) FAGOS SELECTIVAMENTE INFECTIVOS Permite que sólo los fagos portadores de anticuerpos específicos para el antígeno sean infectivos y se propaguen a través de las rondas de amplificación. salvaje infectivo selectivamente proteína III a) Tanto el antígeno como el anticuerpo pueden estar codificados por el genoma del fago, formando parte de operones distintos. b) El antígeno fusionado al extremo amino terminal de la proteína III se encuentra codificado en un plásmido. En ese caso las partículas fágicas se ponen en contacto con el sobrenadante de este cultivo para que tenga lugar el reconocimiento antígeno-anticuerpo.

TIPOS DE GENOTECAS COMBINATORIALES DE ANTICUERPOS INMUNES NATIVAS SINTÉTICAS Obtenidas a partir de individuos o animales sometidos a inmunización con un antígeno. La probabilidad de encontrar un anticuerpo de alta afinidad por el antígeno es alta. No siempre se puede proceder a la inmunización. Algunos antígenos son poco inmunogénicos. Proceden de individuos o animales que no han sido inmunizados. De una misma genoteca se pueden obtener anticuerpos frente a cualquier antígeno, pero la afinidad no suele ser alta. La introducción de diversidad se lleva a cabo in vitro. No se necesita el uso de animales, ni individuos, y se pueden obtener anticuerpos frente a cualquier antígeno a partir de una sola genoteca.

GENERACIÓN DE UNA GENOTECA SINTÉTICA DE ANTICUERPOS HuCAL®-GOLD CysDisplayTM El anticuerpo no está fusionado con la proteína III. Ambas moléculas se expresan en el espacio citoplásmico donde se unen mediante un residuo de cisteína. La formación de este puente disulfuro permite la incorporación del anticuerpo a la cápsida del fago. La liberación de la partícula se lleva a cabo con agentes reductores, de manera que se pueden obtener fragmentos de anticuerpo que presenten alta afinidad por el antígeno La diversidad estructural del repertorio de anticuerpos humanos está representada por 7 genes V de la cadena pesada y 7 genes V de la cadena ligera dando lugar a 49 estructuras que cubren la diversidad estructural de los genes V. Posteriormente las CDRs se han construido a partir de trinucleótidos sintéticos (TRIM) mediante una técnica patentada. Está formada por 10 billones de clones distintos que mimetizan la diversidad del repertorio humano de anticuerpos. Se han incluido codones más usuales en E. coli y se han hecho mutaciones para mejorar el plegamiento de los anticuerpos recombinantes.

MÉTODOS DE ANÁLISIS DE LOS ANTICUERPOS SELECCIONADOS BstN I FINGERPRINTING SECUENCIACIÓN ELISA- PHAGE MÉTODO A antígeno anticuerpo recombinante + enzima fago antígeno biotinilado estreptavidina MÉTODO B BIOSENSORES

GENOTECAS DE SEGUNDA GENERACIÓN: MADURACIÓN DE LA AFINIDAD ANTICUERPO MONOCLONAL ANTICUERPOS SELECCIONADOS CLONES INICIALES DE FAGOS CON ANTICUERPOS RECOMBINANTES MUTAGENESIS IN VITRO MUTAGÉNESIS IN VIVO INTERCAMBIO DE CDRs INTERCAMBIO DE CADENAS INTRODUCCIÓN DE DIVERSIDAD EN LOS GENES V PANNING ANTÍGENO LÍMITE COMPETICIÓN SELECCIÓN DE CLONES CON MAYOR AFINIDAD BIACORE SECUENCIACIÓN ANÁLISIS DE LOS ANTICUERPOS SELECCIONADOS POSTERIOR MADURACIÓN UTILIZACIÓN

INTRODUCCIÓN DE DIVERSIDAD EN LOS GENES V MUTAGÉNESIS in vitro in vivo Error-prone PCR Oligonucleótidos degenerados Mutagénesis dirigida

INTERCAMBIO DE CDRs (CDR SHUFFLING) AMPLIFICACIÓN DE CDRs DE UNA MEZCLA DE LINFOCITOS B REGIONES DE SOLAPAMIENTO AMPLIFICACIÓN DE REGIONES FR DE UN SÓLO GEN V FR2 FR1 FR3 FR4 SOLAPAMIENTO DE REGIONES COMPLEMENTARIAS MEZCLA DE FRAGMENTOS CDRs Y FRs AMPLIFICACIÓN DE LOS GENES V COMPLETOS MEDIANTE OVERLAP-EXTENSION PCR

INTERCAMBIO DE CADENAS (CHAIN SHUFFLING) SELECCIÓN DIRIGIDA O SELECCIÓN GUIADA ANTICUERPO PARENTAL MURINO selección Genoteca VL humana VH murina PRIMERA GENOTECA JERARQUIZADA HIBRIDOS VH ratón + VL humanos selección Genoteca VH humana VL humana SEGUNDA GENOTECA JERARQUIZADA VH MURINA + VL HUMANA ANTICUERPOS VH humana + VL humana

GENOTECAS MULTICOMBINATORIALES DE ANTICUERPOS SIN RECOMBINACIÓN 20:1 VH X/ VL Y VH Y/ VL X CON RECOMBINACIÓN 20:1 RECOMBINACIÓN NUEVAS COMBINACIONES Cre VH X/ VL Y VH Y/ VL X VH Y/ VL Y VH X/ VL X loxP VH VL loxP IDÉNTICAS COMBINACIONES