Conclusiones La concentración parasitaria alcanzada por la cepa de T. cruzi Nicaragua al final del período de crecimiento exponencial in vitro es menor que las alcanzadas por Cl Brener, Tul y Brazil. El análisis de la sensibilidad de los parásitos a las drogas BZ y allopurinol in vitro mostró que la cepa Nicaragua es más sensible al allopurinol que Cl Brener mientras que es menos sensible que Cl cuando es tratada con BZ. El tratamiento con BZ previno la parasitemia y mortalidad inducidas por la infección de ratones con la cepa Nicaragua. Estudios de la sensibilidad al Benznidazol y al allopurinol de un aislado de Trypanosoma cruzi de Nicaragua Noelia Grosso, Miriam Postan, Jaqueline Bua y Laura E. Fichera Instituto Nacional de Parasitologia “Dr. M.Fatala Chabén”, ANLIS/ Malbran,Argentina;, Figura 1: Curvas de crecimiento parasitario in vitro. Introducción El Trypanosoma cruzi es una especie heterogénea, que comprende aislamientos parasitarios con diferente comportamiento in vitro con variados grados de virulencia, tropismo tisular, patogenicidad, etc, determinados en el modelo de infección murina. La caracterización biológica de los aislamientos parasitarios es fundamental para el desarrollo de medidas de control de la transmisión parasitaria, preventivas y terapéuticas de la enfermedad. El objetivo de este trabajo es caracterizar el comportamiento in vitro de un aislamiento de T. cruzi obtenido de Triatoma dimidiata capturado en Nicaragua y su susceptibilidad a las drogas utilizadas actualmente en el tratamiento de la enfermedad de Chagas, benznidazol (BZ) y el allopurinol. El BZ es una droga con probada acción parasiticida, efectiva para el control parasitario en la etapa aguda de la infección, cuando los niveles de parasitemia son mayores, siendo su efectividad menor en la etapa crónica de la enfermedad. El allopurinol de efecto parasitostático sobre el T. cruzi, tiene la capacidad de ingresar al compartimiento intracelular de las células de mamíferos, sitio donde el parásito se multiplica. Nakajima Shimada J y col (1996) han demostrado que el allopurinol ejerce un efecto diferencial sobre la replicación de los parasitos dependiendo del tipo celular infectado. Diferentes estudios muestran que la susceptiblidad del T. cruzi al BZ depende de la cepa del parásito, observándose que 56% de las mismas son susceptibles a la droga, mientras que 17% son parcialmente susceptibles y 27.1 % resistentes. Este amplio espectro de susceptibilidad podría estar relacionado con los linajes predominantes de las subpoblaciones parasitarias presentes en las diferentes áreas geográficas (Toledo MO y col., 2003). Curva de crecimiento: Se determinó la curva de crecimiento de las cepas de T. cruzi Nicaragua, CL Brener, Tulahuen y Brazil en cultivos axénicos, en 3 experimentos independientes. Se colocaron 1x106 parásitos /ml en frascos de polistireno duplicados conteniendo medio de cultivo de cerebro y corazón-triptosa (BHT), suplementado con 10% de suero fetal bovino decomplementado, incubándose en estufa a 28°C, y cuantificándose diariamente el número de epimastigotes en cámara de Neubauer. Para determinar la susceptibilidad al BZ, se agregó la droga a una concentración final de 0,192mM, disuelto en 0,2% DMSO. Los resultados se analizaron con el test de Anova seguido de Bonferroni, considerándose significativo a p ≤ 0,05. IC50: Para la determinación de la IC50, se colocaron 50 microlitros/pocillo de una suspensión parasitaria de 106 epimastigotes/ml de las cepas Nicaragua y CL Brener por triplicado en placas de polistireno de 96 pocillos conteniendo 150 microlitros de BHT con diferentes concentraciones de BZ (rango 0,577mM a 0,018mM) y allopurinol (rango 0,6mM a 0,0188mM), disueltas en 0,2% DMSO. Los parásitos fueron incubados durante 72 hs a 28°C y cuantificados en cámara de Neubauer. La IC50 fue calculada mediante una curva dosis-respuesta. Estudios in vivo: Se inocularon en total 21 ratones C3H/He de 30 días de edad con 106 tripomastigotes/ratón de la cepa de T. cruzi Nicaragua, derivados de cultivos de células Vero, y se trataron 10 de ellos con BZ (100 mg/Kg/día) durante 30 días a partir del segundo día post-infección, con un régimen de tratamiento de 5 días continuados y 2 de descanso, evaluándose la parasitemia y tiempo de sobrevida en 2 experimentos independientes. Se controló diariamente la sobrevida de los ratones, evaluándose los niveles de parasitemia mediante el método de Brener. Materiales y Métodos:Resultados La cuantificación del número de epimastigotes en los cultivos mostró un período de crecimiento exponencial de las cepas Nicaragua y CL Brener de 9 días (Figura 1A), mientras que la cepas Tulahuen y Brazil alcanzaron su plateau a los 10 y 12 días respectivamente (Figura 1B). El número de epimastigotes alcanzado al final del período de crecimiento exponencial de la cepa Nicaragua fué significativamente menor que el de las otras cepas estudiadas (p< 0,025 ) Tabla 1: IC50. Mediante la IC50 se comparó el efecto del BZ sobre las cepas Nicaragua y Cl Brener, observando que Nicaragua fue menos sensible a la acción de la droga (110,9µM) que Cl Brener cuya IC50 fue de 88,67 µM. La IC50 del allopurinol sobre Nicaragua fue de 38,91 µM mientras que en Cl Brener fue de 131,22 µM. Figura 3: Parasitemia y mortalidad de ratones infectados con la cepa de T. cruzi Nicaragua. Todos los ratones infectados con la cepa Nicaragua murieron durante la etapa aguda de la infección, siendo la sobrevida de las hembras mas prolongada que la de los machos y se detectaron parásitos circulantes en todos los animales (Fig. 3). Efecto del tratamiento con BZ en ratones infectados con la cepa de T. cruzi Nicaragua: El tratamiento con BZ de ratones infectados con la cepa Nicaragua revirtió el efecto letal del parásito durante la etapa aguda de la infección, registrándose sobrevida de todos los animales infectados y tratados, con parasitemias por debajo de los niveles de detección del método utilizado. Sin embargo, se detectaron escasos parásitos circulantes en algunos de los animales infectados y tratados con posterioridad a la finalización del tratamiento. Figura 2: Susceptibilidad de T. cruzi al benznidazol. En esta figura se observa el porcentaje de inhibición del crecimiento parasitario por efecto del benznidazol. La adición de 0,192 mM de BZ a los cultivos axénicos de epimastigotes produjo un efecto negativo sobre la multiplicación parasitaria, siendo éste más marcado sobre la cepa Cl Brener, mientras Brazil fue la menos afectada por esta concentración de droga. No se observaron diferencias significativas sobre la inhibicion de la multiplicacion a las 72hs entre las cepas Cl y Tul respecto de Nicaragua, p=0,52 y p= 0,3 respectivamente. El valor es significativo (p= 0,003) cuando se compara con Brazil.