HbA1c y otras hemoglobinas Evaluación del sistema Evaluación del sistema CAPILLARYS 2 Flex Piercing

Una molécula muy original…….. Una modificación post-traducción (glicación) de una proteína (Hemoglobina) en un tejido (sangre) se relaciona con una enfermedad (diabetes mellitus) ……su síntesis se produce como si el sistema fuera inerte

Capillarys2 Flex Piercing® HbA1c Perfil Electroforético

Evaluación Técnica Precisión Linealidad Correlación con HPLC (HPLC Menarini/Arkray ADAMS A1c HA-8160, Menarini Diagnostics) Influencia de la anemia Interferencias analíticas : -Fracción Lábil - Hb Carbamilada -Hb Acetilada -Bilirubina & Triglicéridos Hb variantes (HbS, D, C, E) y HbF Eloísa Urrechaga High resolution HbA1c separation and Hemoglobinopathy detection by Capillary Electrophoresis Am J Clin Pathol 2012; 138:

S. Jaisson, N. Leroy, J. Meurice, E. Guillard, P. Gillery. First evaluation of CAPILLARYS 2 Flex Piercing as a new analyzer for HbA1c assay by capillary electrophoresis Clin Chem Lab Med 2012; 50(10): Fiabilidad

Precisión S. Jaisson, N. Leroy, J. Meurice, E. Guillard, P. Gillery. First evaluation of CAPILLARYS 2 Flex Piercing as a new analyzer for HbA1c assay by capillary electrophoresis Clin Chem Lab Med 2012; 50(10): “On the commercial version tested, the intra-assay CVs were comprised between 0,85% and 1,62% and the between-assays CVs were lower than 1,45% for patient samples.” Protocolo ICLS EP05-A2 C. Weykamp, H. Waenink-Wieggers, E. Kemna, C. Siebelder HbA1c: Performance of the SEBIA CAPILLARYS 2 Flex Piercing Clin Chem Lab Med 2012; 51 (6):

Precisión Intra serie: 3 muestras con niveles HbA1c alto, medio y bajo se analizan en los 8 capilares Media 5.2 % 33 mmol/mol CV 1.4 % 7.2 % % 10.9 % % Inter serie: 8 muestras con niveles HbA1c en un amplio rango se analizan simultanáneamente en los 8 capilares, se repite 3 veces Media 4.6 % 27 mmol/mol CV 1.35 % 4.9% % 5.5 % % 7.2 % % 8.5 % % 9.5 % % 10.3 % % 12.4 % %

Kim Lee & Paul Williams Evaluation of the SEBIA quantitative HbA1c capillary electrophoresis instrument Poster presented at Australian Diabetes Society Congress 2012

Linearidad Se aplica regresión lineal para comparar los resultados teóricos y los obtenidos de una serie de muestras preparados con diluciones seriadas de 2 muestras con HbA 1C alta (14.3 %, 133 mmol/mol) y baja (5.1 %, 32 mmol/mol) y = 1.02 x , R 2 = 0.997

Correlación Menarini/ARKRAY ADAMS A1c HA-8160 n=107 rango % ( mmol/mol) R 2 = y = 1.00 x Diferencia media 0.2 % No se empleó método de referencia

Efecto de la concentración de hemoglobina Se centrifuga una muestra durante 10 minutos a 300 rpm para separar las células del plasma. Células y plasma se mezclan en proporciones 9:1, 8:2…1:9

Hb Glicada y otras Hemoglobinas: amenaza y oportunidad

Hb modificadas químicamente Interferencia analítica es el error sistemático producido por una sustancia distinta de la que se pretende medir en un procedimiento analítico. Hb modificadas químicamente son potencialmente interferentes debido a la separación incompleta de HbA1c. Fracción A 1c lábil : se preparan muestras añadiendo cantidades crecientes de una solución de glucosa, hasta concentraciones mg/dL. Se incuban a 37 0 C durante 2 horas. Hb carbamilada : se preparan muestras de concentración mg/dL de cianato sódico. Se procede como en el apartado anterior. Hb acetilada : se preparan muestras de concentración mg/dL de acetaldehído. Se procede como en los casos anteriores

La HbA1c lábil esta formada por la unión inestable de glucosa al grupo amino N-terminal de las cadenas de globina de la HbA0. ValValGluGluGluGluProProThrThrLeuLeuHisHisLysLys Glucosa NH 2 Presenta una importante variación biológica debida a fluctuaciones recientes de la glucemia en sangre. Fracción muy inestable: la mayoría de HbA1c lábil libera rápidamente la glucosa volviendo al estado no glicado HbA0.

HbA1c lábil no interfiere en la cuantificación de HbA1c

La carbamilación tiene lugar en individuos normales y de forma muy acentuada en pacientes con función renal reducida y niveles elevados de urea en suero. Hb carbamilada no interfiere en la cuantificación de HbA1c

La acetilación in vivo del grupo N-terminal de las cadenas de globina tiene lugar en pacientes alcohólicos, mujeres embarazadas y en pacientes con altas dosis de aspirina. ValValGluGluGluGluProProThrThrLeuLeuHisHisLysLys Ácido acetilsalicílico NH 2 La acetilación tiene lugar principalmente en las cadenas γ (HbF). La HbA acetilada puede representar hasta un 1.1% de la Hb Total en pacientes tratados con aspirina durante un largo período de tiempo (4g por día durante 4 meses).

Hb acetilada no interfiere en la cuantificación de HbA1c

Resultados HbA 1C no se modifican por HbF 15 % Bilirraubin 282 µmol/L Triglicéridos 18 mmol/L “No analytical interference of bilirubin and triglycerides was noticed for concentrations reaching 304 μmol/L and 12.8 mmol/L, respectively.”

D Sacks Clin Chem 2003; 49(8):

“CAPILLARYS 2 Flex Piercing did not show any clinically significant interference with any of the variant traits evaluated (HbS, HbC, HbD and HbE).” “The presence of HbS trait produced statistically significant differences for all methods except CAPILLARYS 2 Flex Piercing.” R. R. Little, S. E. Hanson, C. L. Rolhfing, S. Jaisson, P. Gillery, W. L. Roberts Effects of Hb C, D, E, and S traits on measurements of HbA1c by six methods Clinica Chimica Acta 2012; 413 :

Hb A/S Hb A/D Las variantes HbS y HbD no interfieren en la cuantificación de HbA1c Hb S1cHb D1c HbS HbD Las variantes HbS y HbD y sus fracciones HbS1c y HbD1c migran separadas de los picos de HbA0 y HbA1c

En los heterozigotos de HbC y HbE existe un solapamiento de pico X 1c con el pico de A 0. A/C: La cuantificación de HbA 1c es posible restando el area esperada de HbC1c del pico de HbA 0 mediante un cálculo que realiza el software automáticamente. A/E: Sin interferencia en la cuantificación de HbA1c.

Perfil atípico Petición de identificación de variante

Normal HbA1c > 7 % 53 mmol/mol Perfil Anormal

Hospital Galdakao Usansolo habitantes 1000 hemogramas/día 220 HbA1c /día De media 2 β talasemia /día 1 α talassemia / semana Microcitosis Eritrocitosis Isocromía HbA2 ALTA Beta TalasemiaRR o BAJA B M alfa Talasemia

HbA 2 características analíticas Reproducibilidad Media 2.2 % CV 1.9 % Media 4.6 % CV 1.0 % Linearidad ( %) R 2 =0.995 y = x Efecto de concentración de hemoglobina total rango 19.5 – 3.9 g/dL Hb HbA %, 0.1 %

β talasemia screening? HbA 2 se analizó con el programa HbA 1C de CAPILLARYS 2 Flex piercing ® 279 muestras de población normal Valores de HbA % % 64 muestras de portadores de beta- talasemia Valores de HbA % %

β talasemia screening? HbA 2 se analizó con el programa HbA 1C de CAPILLARYS 2 Flex piercing ® y en paralelo empleando el programa Hb 60 individuos normales y 64 portadores de β talasemia Correlación, R 2 = y = x diferencia media- 0.3 %

Fracciones de Hemoglobina Amenaza otras Hb químicamente modificadas Hb lábil Hb Carbamilada Hb Acetilada Amenaza pero Oportunidad Hb variantes Oportunidad HbA2 Detección de portadores de β talasemia

Conclusiones Nuevo método de HbA1c analizar con separación de fracciones Primer sistema de electroforesis capilar para Laboratorios Clínicos Alta productividad + alto rendimiento análitico Débil impacto de las interferences analíticas más frecuentes (A1c lábil, Hb carbamilada y acetilada, triglycerides,bilirrubina) en los resultados Es posible la cuantificación de HbA1c en presencia de las Hb variantes más comunes en nuestra área Capillarys 2 Flex Piercing HbA1c kit Es un método de calidad adecuado para su uso en rutina en los Laboratorios Clínicos

Hospital Galdakao Usasolo Galdakao, Vizcaya SPAIN 43N03W