Daño y reparación del DNA

Daño al DNA Cambios en la secuencia debidos a: Errores en la replicación.(Dna pol) Agentes del ambiente Mutágenos químicos Radiaciones

Si los cambios no son reparados Las células en proliferación o quiescentes acumularían tantas mutaciones que morirían. En las células de la línea germinal pueden encontrarse mutaciones y estas se expresarán en la progenie.

Cáncer Es una serie de enfermedades que tiene como característica Carcinógenos, si el daño que causan frecuentemente lleva a desarrollar cáncer.

Lesiones del DNA SOURCE: Adapted from A. Kornberg and T. Baker, 1992, DNA Replication, 2d ed., W. H. Freeman and Company, pp. 771 – 773.

Corrección de pruebas de la DNApol Las DNA pol adicionan nucleótidos complementarios al molde. Las subunidad a de la polimerasa III de E.coli incorpora un error cada 104 nucleótidos que adiciona. Cada gen de E.coli tiene 103 bases, entonces habría un error cada 10 genes replicados.

Frecuencia de mutación O sea 10-1 mutaciones por gen y por generación. Se ha determinado experimentalmente que la frecuencia es menos de 1 falta cada 109 nucleótidos equivalente a 10-5 a 10-6 mutaciones por gen y por generación.

Actividad de exonucleasa 3’5’

Dna pol III E.coli

Casi todas la DNA pol presentan actividad de exonucleasa 3’-->5’ Excepto la polimerasa alfa de eucariotes. Si se muta el sitio o la subunidad con actividad de corrección la tasa de mutación aumenta 1000 veces en promedio

Agentes mutagénicos in cancerígenos

De acción directa Son electrófilos activos. Reaccionan químicamente con el nitrógeno o el oxígeno del DNA Modifican los nucleótidos distorsionando el patrón normal de apareamiento

De acción indirecta No son reactivos Son insolubles en agua Deben ser modificados por introducción de centros electrofílicos La activación se lleva a cabo por enzimas “detoxificadoras”

Reparación del DNA Las lesiones al DNA pueden ocurrir en células en división pero también en células que no se dividen. Si el proceso de reparación fuera óptimo, no habría acumulación de errores. La acumulación de errores lleva al envejecimiento.

Types of DNA damage Base modification & Deamination Base Loss Base modification & Deamination Chemical Modification Photodamage Inter-strand crosslinks DNA-protein crosslinks Strand breakage

Base loss Abasic site -loss of a nucleobase (apurinic or apyrimidinic) Deamination Base loss The glycosyl bond linking DNA bases with deoxyribose is labile under physiological conditions. Within a typical mammalian cell, several thousand purines and several hundred pyrimidines are spontaneously lost per haploid genome per day. Loss of a purine or pyrimidine base creates an apurinic/apyrimidinic (AP) site (also called an abasic site) Deamination The primary amino groups of nucleic acid bases are somewhat unstable. They can be converted to keto groups in reactions like the one pictured here:

Potential Sites of modification/damage Many environmental chemicals, including "natural" ones (frequently in the food we eat) can also modify DNA bases, frequently by addition of a methyl or other alkyl group (alkylation). In addition, normal metabolism frequently leads to alkylation. It has been shown that S-adenosylmethionine, the normal biological methyl group donor, reacts accidentally with DNA to produce alkylated bases like 3-methyladenine at a rate of several hundred per day per mammalian haploid genome. Alkylation occurs most readily at the nucleophilic positions shown in this diagram (the darker orange circles denote the most reactive positions):

Chemical Damage Alkylation Oxidative damage Chemical modification The nucleic acid bases are susceptible to numerous modifications by a wide variety of chemical agents. For example, several types of hyper-reactive oxygen (singlet oxygen, peroxide radicals, hydrogen peroxide and hydroxyl radicals) are generated as byproducts during normal oxidative metabolism and also by ionizing radiation (X-rays, gamma rays). These are frequently called Reactive Oxygen Species (ROS). ROS can modify DNA bases. A common product of thymine oxidation is thymine glycol: Many environmental chemicals, including "natural" ones (frequently in the food we eat) can also modify DNA bases, frequently by addition of a methyl or other alkyl group (alkylation). In addition, normal metabolism frequently leads to alkylation. It has been shown that S-adenosylmethionine, the normal biological methyl group donor, reacts accidentally with DNA to produce alkylated bases like 3-methyladenine at a rate of several hundred per day per mammalian haploid genome. Alkylation occurs most readily at the nucleophilic positions. Oxidative damage

UV-induced damage Thymine dimers

La reparación en E. coli. Reparación de mal-apareamiento, ocurre inmediatamente después de la síntesis de DNA. Photolyase De-alkylation proteins (not catalytic) Reparación por escisión, remoción de una región dañada por nucleasas especializadas y síntesis de DNA para llenar el hueco. Base Excision Repair Nucleotide Excision Repair (GG and TC) Recombination Repair Error-prone Repai Reparación de rompimientos de cadena doble, ocurre por un proceso de unir los extremos.

UV-responsive photolyases

Direct reversal (de-alkylating proteins)

Base Excision Repair

Base Excision Repair The "pathway" most commonly employed to remove incorrect bases (like uracil) or damaged bases (like 3-methyladenine) is called "base excision repair". Actually, it's misleading to talk about this as a pathway, because there are numerous variations, each specific for a different type of incorrect base. Nevertheless, all of the variant pathways have features in common, and each of the pathways can be considered to consist of 3 steps, with steps 2 and 3 being common for all pathways: 1. Removal of the incorrect base by an appropriate DNA N-glycosylase to create an AP site 2. Nicking of the damaged DNA strand by AP endonuclease upstream of the AP site, thus creating a 3'-OH terminus adjacent to the AP site 3. Extension of the 3'-OH terminus by a DNA polymerase, accompanied by excision of the AP site

Nucleotide Excision Repair (E.coli)

Nucleotide Excision Repair (Global Genome Repair -Humans)

Nucleotide Excision Repair (Transcription Coupled -Humans)

Common features of GGR & TCR

Mismatch Repair

Recombination Repair Other possible mechanisms of recombination repair

Error Prone Bypass (E. coli)

Experimental evidence for Error prone repair (E.coli) Revertant in His- genes (umuC mutated strain) UV-responsive activation of the umuC gene

Reparación de mal-apareamiento

Los sistemas de reparación de mal-apareamiento Reconocen los malos apareamientos excepto C--C. Reconocen la cadena normal si existe un sistema lento de metilación mediante el sistema MutHLS.

Mutaciones en Mut H, S o L aumenta la tasa de mutaciones espontáneas Fallas en la metilasa Dam también incrementan la tasa de mutación. Un mecanismo similar repara las lesiones de depurinación o de depirimidinación. La depurinación es muy común en mamíferos. Todas las células presentan endonucleasas apurínicas que cortan la hebra del DNA cerca del sitio apurínico.

Reparación por escisión Repara regiones que presentan bases modificadas y que alteran la forma normal de la doble hélice. Ej dímeros de timidina o citocina.

Dímero de timina

Sistema UvrABC de reparación por escisión Primero, se forma un complejo de dos moléculas de UvrA y una de UvrB y se unen al DNA. Tanto la formación del complejo como la unión al DNA requiere ATP. Parece que la unión es sobre DNA no dañado. El complejo se transloca sobre la doble hélice hasta encontrar una distorsión. Gasta ATP.

Dímero de Timidina Proteína de reconocimiento del daño Dímero de timidina. Se puede obbservar el dímero en blanco y la enszima reparadora reconociendo el sitio en dónde la Adenosina se encuentra por fuera de la estuctura del DNA.

Reparación de unión de extremos de DNA no homólogo Una célula que tienen una doble cadena rota, generalmente tiene más rompimientos. Los rompimientos se reparan uniéndolos y evitando la pérdida de material aunque se rearregle. Este rearreglo puede dar alteraciones pero el DNA es egoísta y si el queda entero no importa que la célula cambie.

Hay dos mecanismos Reparación por recombinación homóloga, que repara correctamente. Reparación por reunión de extremos, en que se pierden varias bases del extremo o reúne extremos de diferentes regiones cromosomales.

Reparación en eucariontes Los mecanismos de reparación se han conservados en la evolución Existe un sistema homologo a Mut, reparación por escisión. Se ha demostrado un sistema de reparación ligado a la transcripción en dónde interviene TFIIH, una helicaza.

Nucleotide Excision Repair (Global Genome Repair -Humans)

Nucleotide Excision Repair (Transcription Coupled -Humans)

Common features of GGR & TCR

Sistemas de reparación inducibles Se activan cuando hay un daño extenso al DNA. En bacterias es el sistema SOS. Se activa con daño extenso ej. UV La tasa de mutación es más alta después de la reparación por este sistema que si no existiera. Mutantes sin sistema SOS presentan menor tasa de mutación.