TALLER DE APLICACIONES PRÁCTIAS 1 Dra. María Isabel Fonseca

Desnaturalización – renaturalización del DNA

Polymerase Chain Reaction (PCR) Es objetivo de la PCR obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mínimo; en teoría basta partir de una única copia de ese fragmento original, o molde. Se llama "cadena", porque los productos de la primera reacción se convierten en sustratos de la siguiente, y así sucesivamente. Kary Banks Mullis Premio novel de Química en 1993

Componentes necesarios para realizar PCR ADN target: que contiene la secuencia que se desea amplificar Dos de cebadores (S y AS) que delimitan la secuencia que se va a amplificar dNTPs sustratos para la síntesis ADN polimerasa termoestable que cataliza la reacción Iones Mg++ Cofactor de la enzima Sn buffer mantiene el pH y la fuerza iónica en la reacción necesario para una adecuada actividad del enzima agua

Controles utilizados en la PCR + -

Etapas del proceso

El equipo utilizado para realizar la PCR Tubos con PCR TERMOCICLADOR

PCR Desnaturalización Templado Elongación 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’

* *

El equipo utilizado para realizar la PCR ANÁLISIS DE PCR Visualización Electroforesis - +

Marcadores Moleculares

MARCADORES MOLECULARES LOS MARCADORES MOLECULARES SE DEFINEN COMO TODO O CUALQUIER FENOTIPO MOLECULAR ORIUNDO DE UN GEN QUE SE EXPRESA, COMO EN EL CASO DE LAS ISOENZIMAS, O DE UN SEGMENTO ESPECÍFICO DE ADN (CORRESPONDIENTE A REGIONES QUE SE EXPRESAN O NO DEL GENOMA). PUEDEN SER MARCADORES MOLECULARES LAS PROTEÍNAS (Ag E ISOENZIMAS) Y EL ADN (REGIONES CODIFICANTES O NO CODIFICANTES)

MARCADORES MOLECULARES DNA RNA transcripción Proteína traducción Secuencias o moléculas de DNA Secuencias o moléculas de RNA Secuencias o moléculas de Proteínas MARCADORES MOLECULARES

Marcadores moleculares Secuencias conocidas Fáciles de detectar y seguir en la población Codificantes o no codificantes Secuencias conservadas Secuencias polimórficas

Secuencias polimórficas Variabilidad genómica poblacional Análisis de diversidad Identificación de individuos El grado de polimorfismo permite distinguir la utilidad del marcador

Polimorfismo (mutaciones con frecuencia mayor al 1%) - Varios alelos por locus. ATGCCGCGCTT ATGCCATGCTT ATGCTGCGCTT

Polimorfismos Génico No génico Grupos del sistema ABO Isoenzimas No ejercen presión selectiva Minisatélites y microsatélites SNP no génicos

Secuencias relativamente conservadas Grado de conservación y disponibilidad determina la utilidad (ej. Especies, variedades, formas especiales) Regiones STS para mapear genomas Regiones ETS para mapear transcriptomas Familias génicas y genes homólogos

STS (Sitios etiquetados por la secuencia) Marcadores moleculares: secuencias conservadas STS (Sitios etiquetados por la secuencia) DNA ETS (secuencias etiquetadas expresadas) mRNA cDNA

Marcadores moleculares: secuencias polimorficas SNP (polimorfismo de simple nucleótido) STR (microsatélites) VNTR (minisatélites) RFLP (sitios de cortes de enzimas de restricción) RAPD (fragmentos amplificados al azar)

MARCADORES MOLECULARES (MM) ¿Secuencias conocidas o desconocidas? Variabilidad - polimorfismo Factibilidad técnica de reconocerla

¿Qué encontramos en un segmento de cromosoma humano? Brown, T. A. Genomes. 2nd ed. Oxford, UK: BIOS Scientific Publishers Ltd; 2002 . http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books

Secuencias repetidas en tándem Unidad de repetición: 10-65 pb Bloque 100 a 1.000 u Minisatélites ATGCGTGGTCTAGGCTCTAATGCCTGAACTAGGCTCTAATGCCTGAACTAGGCTCTAATGCCTGAATTCGG Unidad de repetición: 2-6 pb Bloque <50 u Microsatélites ATGCGAATGTGGTCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGTTCGGCGTTTGAAGT

VNTR: minisatélites (variación del número de repeticiones)   Enzima de restricción Alelo A sonda sonda Alelo B sonda 3 genotipos posibles AA AB BB Electroforesis + hibridación con sonda (Southern blot) + AA 2 cortos AB 1 corto y 1 largo BB 2 largos

ENZIMAS DE RESTRICCIÓN EcoRI Escherichia coli HindIII Hemophilus influenzae ......G-A-A-T-T-C...... ......C-T-T-A-A-G...... A-A-T-T-C...... G...... ......G ......C-T-T-A-A ......A-A-G-C-T-T...... ......T-T-C-G-A-A...... A-G-C-T-T...... A...... ......A ......T-T-C-G-A-A Sma I Serratia marcescens ......C-C-C-G-G-G...... ......G-G-G-C-C-C...... G-G-G...... C-C-C...... ......C-C-C ......G-G-G

ESTRUCTURA de STR

DISEÑO DE CEBADORES

Microsatélites + Amplificación: PCR Alelo A Alelo B genotipos posibles AA: 2 copias de 4 repeticiones = 4 repeticiones AB: 4 repeticiones + 5 repeticiones AC: 4 repeticiones + 6 repeticiones AD: 4 repeticiones + 7 repeticiones BB: 5 repeticiones BC: 5 repeticiones + 6 repeticiones BD: 5 repeticiones + 7 repeticiones CC: 6 repeticiones CD: 6 repeticiones + 7 repeticiones DD: 7 repeticiones Electroforesis AA AB AC AD BC BD CD + Alelo C Alelo D 7 6 5 4

10 min para Resolver

SNP: Polimorfismos de simple nucleótido http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp Haplotipo 1: TTCGCGTGTCCGTAATGCTGATGA Haplotipo 2: TTCGCGTGTCCGGAATGCTGCTGA Haplotipo 3: TTCGCATGTCCGTAATGCTGCTGA G/A T/G A/C CTAGGCTCTAATGCCTGAA CTAGGCTTTAATGCCTGAA

RFLP: Variación en sitios de corte de enzimas de restricción     Enzima de restricción sonda sonda 3 genotipos posibles AA AB BB Electroforesis + hibridación con sonda (Southern blot) + AA 2 cortos AB 1 corto y 1 largo BB 2 largos

RFLP: Variación en sitios de corte de enzimas de restricción     Enzima de restricción sonda sonda 3 genotipos posibles AA AB BB Electroforesis + hibridación con sonda (Southern blot) + AA 2 cortos AB 1 corto y 1 largo BB 2 largos

RFLP: Ejemplo (detección de HbS) Porción de DNA del cromosoma 11 exón 1 intrón A exón 2 ...    Alelo A bA-globina NORMAL CCTTAGG CCTGAGG CCTGAGG dianas de Mst II Alelo A bS-globina FALCIFORME CCTTAGG CCTGAGG CCTGAGG dianas de Mst II 1,2 kb 0,2 kb Digestión con Mst II AA AS SS Sonda 1 1,4 kb 1,2 kb 0,2 kb AA AS SS Sonda 2 1,4 kb 1,2 kb 0,2 kb

PCR-RFLP: análisis de sitios de restricción Fragmento del gen X exón 1 intrón A exón 2  Mst II Alelo A CCTGAGG Alelo B CCTTAGG 1,2 kb 0,2 kb Digestión con Mst II AA AB BB 1,4 kb 1,2 kb 0,2 kb

15 min para Resolver El polimorfismo A>G en el codón 655 del gen que codifica para la región transmenbrana del receptor HER2 provoca un cambio aminoacídico de Ile>Val que impulsaría la actividad tirosina quinasa del receptor de manera constitutiva. Como HER2 es el recepetor del factor de crecimiento, su actividad constitutiva implicaría que envié señales al nucleo activando genes involucrados en la proliferación celular. Las células con este polimorfismo crecen descontroladamente generando tumores que pueden derivar en un cáncer epitelial u otro dependiendo de donde se produce el crecimiento descontrolado. Producto de PCR: 300 pb En sitio de reconocimiento para la enzima se encuentra G originado un fragmento de 100 y otro de 200 pb. Esquematice todos los posibles resultados que obtendría al realizar la digestión con la enzima de restricción definiendo todos los genotipos posibles.

Marcadores para genomas desconocidos Cuando no se disponen de datos genómicos. Asociación fortuita con fenotipos, pero de base genómica. Identificación de especies, variedades, grupos poblacionales acorde con el grado de polimorfismo

RAPD

Amplificación y análisis del rDNA

Marcadores de expresión: mRNA

Aplicaciones: análisis filogenético selección asistida por marcador pruebas de paternidad y trazabilidad de los alimentos Estudios de linfomas, sarcomas y otros tumores. Estudios de genes supresores de tumores y oncogenes. Agentes infecciosos Estudios de identidad etc…

…en conclusión Los marcadores moleculares constituyen una herramienta de la Biología Molecular que permiten el análisis del genoma a través de diferentes estrategias.

Enlaces que se utilizaron en el diseño Modern Genetic Analysis. Griffiths, Anthony J.F.; Gelbart, William M.; Miller, Jeffrey H.; Lewontin, Richard C. New York: W. H. Freeman & Co.; c1999. Molecular Biology of the Cell. 3rd ed. Alberts, Bruce; Bray, Dennis; Lewis, Julian; Raff, Martin; Roberts, Keith; Watson, James D. New York and London: Garland Publishing; c1994. Molecular Cell Biology. 4th ed. Lodish, Harvey; Berk, Arnold; Zipursky, S. Lawrence; Matsudaira, Paul; Baltimore, David; Darnell, James E. New York: W. H. Freeman & Co.; c1999. Human Molecular Genetics 2. 2nd ed. Strachan, Tom and Read, Andrew P. Oxford, UK: BIOS Scientific Publishers Ltd; 1999. Genomes. 2nd ed. Brown, T. A. Oxford, UK: BIOS Scientific Publishers Ltd; 2002