BIOLOGÍA MOLECULAR TECNOLOGÍAS EN BIOLOGÍA MOLECULAR Y DNA RECOMBINANTE. TEMAS Alondra Olivia Chavez Amaya UNIVERSIDAD AUTONOMA DE CHIHUAHUA FACULTAD DE DIENCIAS QUIMICAS

INDICE Objetivos Errores mas frecuentes. Tecnologías en biología molecular y DNA recombinante. Digestión de DNA con enzimas de restricción. Mapas de restricción. Electroforesis en geles de agarosa. Bibliografía.

OBJETIVOS Reconoce los fundamentos químicos para el aislamiento de DNA de organismos. Conoce las características y funciones de los plasmidos bacterianos. Explica el procedimiento para el aislamiento de plasmidos y su cuantificación. Reconoce las propiedades y funciones de las enzimas de restricción. Explica los procedimientos para la elaboración de mapas de restricción de genes y genomas, así como la importancia de este análisis para la caracterización del DNA. Reconoce los fundamentos de la electroforesis para la separación de ácidos nucleicos. Explica los procedimientos para la separación de fragmentos de DNA, por medio de electroforesis submarina en geles de agarosa, así como la importancia de este análisis para la caracterización del DNA

ERRORES FRECUENTES Confundir la acción de las enzimas que participan en la digestión del DNA. No comprender el sentido de los mapas de restricción.

Tecnologías en biología molecular y DNA recombinante Creación de nuevas combinaciones de segmentos o moléculas de DNA. Se reserva a las moléculas de DNA que proviene de diferentes fuentes biológicas. El proceso consiste en tomar una molécula de ADN de un organismo, sea un virus, planta o una bacteria y en el laboratorio manipularla y ponerla de nuevo dentro de otro organismo.

ESQUEMA BASICO Vector + Fragmento de DNA DNA Recombinante Replicación del DNA recombinante dentro de las células huésped Aislamiento, secuenciación y manipulación del fragmento de DNA purificado

Enzimas de restricción También conocidas como endonucleasas, cortan los enlaces fosfodiester a partir de ua secuencia que reconocen. La secuencia que reconocen es una secuencia palindrómica (secuencia que se lee igual en ambas direcciones). Son extraídas de bacterias, donde actuan como mecanismo de defensa para degradar material genético extraño que entre en la célula. Las enzimas - BamHI, HindIII y EcoRI, toman el nombre de las bacterias que la producen: –EcoRI: E = género Escherichia. co = especie coli R = cepa RV 13 I = primera endonucleasa aislada de esta cepa

TIPOS DE ENDONUCLEASAS -Las del tipo I cortan el DNA al azar.* -Las de tipo III cortan el DNA a unos 25 pb de la secuencia de reconocimiento.* -Las de tipo II no necesitan ATP y cortan el DNA en la misma secuencia de reconocimiento. * Se mueven a lo largo del DNA mediante un mecanismo que requiere ATP

CLONACION EN E. coli E. coli fue el primer organismo utilizado y todavía es la célula huésped mas común. Tiene muchas ventajas: -Se conoce bien el metabolismo de su DNA. -Muchos vectores de clonación que se encuentran asociados de manera natural, están bien caracterizados -Se dispone de técnicas efectivas para la transferencia de DNA de una bacteria a otra.

CORTE DE MOLECULAS DE DNA MEDIANTE ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION. Los fragmentos pueden ligarse a un plasmido

CORTE DE MOLECULAS DE DNA MEDIANTE ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION Un fragmento sintético de DNA que contenga las secuencias de reconocimiento de varias endonucleasas de restricción se puede insertar en un plásmido tratado previamente con una endonucleasa de restricción

Electroforesis de DNA: –Después de tratar el lambda DNA con las diferentes enzimas, los fragmentos son separados por su tamaño usando un gel de electroforesis. –Luego de que la gel se “corre” el DNA se tiñe para revelar los patrones de bandas formados en el gel que corresponden a fragmentos de diferentes tamaños.

Principios de electroforesis Técnica usada para separar y purificar macromoléculas (i.e. proteinas, ácidos nucleicos) que varían en tamaño, carga o conformación. Cuando moléculas cargadas son colocadas en un campo eléctrico, estas migran hacia el polo positivo (ánodo) o polo negativo (cátodo) de acuerdo a su carga.

Geles comúnmente usados: Agarosa: polisacárido extraido de algas. No tóxico. Poco poder de resolución pero alto grado de separación. Separa fragmentos de DNA de 200 a 50,000 pb. Poliacrilamida: polímero de acrilamida. Tóxico. Menor grado de separación pero alto poder de resolución. Usado para fragmentos de DNA de 500 pb. Usado para separar mezclas de proteínas.

BIBLIOGRAFIA Nelson, D; Cox, M. LEHNINGER PRINCIPIOS DE BIOQUIMICA. 4ª edicion. Edit. Omega. Pags Alberts y cols. BIOLOGIA MOLECULAR DE LA CELULA. 4ª edicion. Ediciones Omega. Pags Lodish y cols. BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR. 5ª edicion. Ed. Medica Panamericana. Pags. Karp, G. BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR. 4ª edicion. Edit. Mc Graw Hill. Pags