ELECTROFORESIS EN GELES DE AGAROSA UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE QUÍMICA ELECTROFORESIS EN GELES DE AGAROSA Arellano Sánchez Claudia Celene Bautista Pérez Sandra Kuri Pineda Antonio Elías Rojas Cortés Jennifer

Fundamento Electroforesis. «Electro» se refiere a la electricidad y «foresis», del griego phoros, significa «trasladar». Separación de moléculas Matriz tamponada (agarosa, acrilamida, almidón). Separacion de las moléculas. Campo eléctrico. Tamaño y la carga neta que poseen.

Polisacárido lineal (con peso molecular ~12 000 Da) Extraído de las algas Polisacárido lineal (con peso molecular ~12 000 Da) Repetición de la unidad básica, la agarobiosa, que comprende unidades alternadas de galactosa y 3,6- anhidrogalactosa. D-galactosa 3,6-anhidro-L-galactosa

Agarosa % Agarosa Tamaño de ADN (pb) 0.75 10000-15000 1.0 500-10000 Al endurecerse, la agarosa forma una matriz cuya densidad viene determinada por su concentración Suspensión de agarosa seca en polvo en un tampón acuoso. Formación de un gel rígido. Bandas tendencia a ser difusas y a esparcirse. Un fragmento de ADN migra a diferentes velocidades a través de los geles según la concentración de agarosa. Electroforesis rápida, pero con una resolución limitada. Agarosa % Agarosa Tamaño de ADN (pb) 0.75 10000-15000 1.0 500-10000 1.25 300-5000 1.5 200-4000 2.0 100-2500 2.5 50-1000

Buffer de corrida Fosfatos que le dan carga negativa a la molécula La movilidad electroforética del ADN afectada por la composición y la fuerza iónica. En ausencia de iones, la conductancia eléctrica es mínima y el ADN migra lentamente o ni siquiera se desplaza. Con elevada fuerza iónica la conductancia eléctrica es muy elevada y se genera una importante cantidad de calor. Generalmente el gel se funde y el ADN se desnaturaliza. Contienen EDTA (pH 8,0) y tris-acetato (TAE), tris-borato (TBE) o trisfosfato (TPE) a una concentración de aprox. 50 mM (pH 7,5 – 7,8). EDTA vs degradacion enzimática.

Buffer de carga xylene cyanol FF Migra a aprox 4Kb; Azul de bromofenol Por lo general contiene agua, sacarosa y un colorante (por ejemplo, cianol de xileno, azul de bromofenol, verde de bromocresol, etc.). glicerol xylene cyanol FF Migra a aprox 4Kb; Azul de bromofenol 1) Ayuda a visualizar que la muestra este migrando en el gel 2) migra a una velocidad equivalente a si tuviera un peso de 200 a 400 pb DNA (depende del porcentaje de la agarosa) GLICEROL Añade densidad a la muestra aumentar la densidad de las muestras para que las gotas de ADN caigan uniformemente en el pocillo Añadir color a la muestra, El tampón de carga se emplea con tres fines: incorporar un colorante a la muestra que, en un campo eléctrico, se desplace hacia el ánodo a una velocidad previsible. pocillo

Para cuantificar y visualizar el DNA se usan agentes colorantes fluorescentes, los cuales aumentan notablemente su emisión cuando se unen a la doble hélice. Son agentes intercalantes que se introducen entre las bases del DNA. Generalmente son policíclicos aromáticos, hidrofobos y planares: BROMURO DE ETIDIO SYBR Safe DNA gel staining (invitrogen)

Bromuro de etidio y SBR blue 7 Estos agentes interrumpen la alineación y emparejamiento de las bases de las cadenas complementarias. La emisión de fluorescencia se da cuando se unen al DNA de cadena doble y depende directamente de la cantidad de éste. Bromuro de etidio

Bromuro de etidio y SBR blue 7 Generalmente se usa en la detección de DNA de doble cadena en PCR en tiempo real. Es estable a un amplio rango de temperaturas. Es 25 veces más sensible que el bromuro de etidio. Es el más utilizado en biología molecular Teratogénico Puede causar metahemoglobinemia

Se trata de reactivos mutagénicos, por lo que se deben trabajar con equipo de seguridad. El material contaminado con ellos generalmente se trata con nitrito sódico y ácido hipofosforoso para su degradación. También son usados en PCR, citometría de flujo y separación de ácidos nucleicos por ultra-centrifugación.

Comparación de electroforesis en gel de agarosa y en gel de poliacrilamida-SDS

Electroforesis en gel Utiliza como soporte un gel de poliacrilamida o agarosa. Las moléculas se separan de acuerdo con su tamaño por su efecto de filtración por geles, y también se separan por su carga. Para teñir a las moléculas sujetas a separación se usan a) colorantes, b) autorradiografía o c) Western blot.

En el DNA, las diferencias de carga no son suficientes para determinar una separación eficaz. ESENCIALMENTE CARGADO NEGATIVAMENTE (FOSTATOS) Electroforesis en gel: la forma y la carga son menos importantes, y la longitud molecular es el determinante crítico de la velocidad de migración. EN PRESENCIA DE SDS

Gel de agarosa Gel de poliacrilamida-SDS Es más frecuentemente usado para separar ácidos nucleicos. Es más frecuentemente usado para separar proteínas.

Cuando se separa DNA Gel de agarosa Gel de poliacrilamida-SDS En ambos casos, el gel se prepara con distintas concentraciones en función del tamaño de los fragmentos de DNA que se quieren separar. Los fragmentos de DNA que puede separar son de hasta 20 kpb (más grandes). Se usan para separar fragmentos de ADN más pequeños (aproximadamente hasta 1000 pb), ya que tienen mayor poder de resolución.

Cuando se separan proteínas Gel de poliacrilamida-SDS Gel de agarosa Separa a la proteína únicamente basado en la carga molecular neta. No separa proteínas con diferentes tamaños pero con cargas similares. Separa proteínas basado tanto en carga eléctrica como en tamaño molecular. Separa proteínas con diferentes tamaños pero con cargas similares. Mayor resolución que la que se obtiene en un gel de agarosa.

Gel de agarosa Gel de poliacrilamida-SDS Corren en forma horizontal (submarina.) Suelen emplearse en forma vertical.

Gel de agarosa Gel de poliacrilamida-SDS En muestras de ADN que se someten a un campo eléctrico durante cierto tiempo, podemos verlas separadas según su tamaño. Se usan estándares de peso molecular Para estimar las masas macromoleculares comparando la muestra con estándares.

Gel de agarosa Gel de poliacrilamida Aplicaciones: El análisis de fragmentos de polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción. Análisis de experimentos de DNA recombinante. Purificación de sondas para ISH. Hibridación por escisión de fragmentos de DNA de un gel seguidos por purificación en mini-columna. Análisis del punto final de PCR. Ensayos RT-PCR (detección de patógenos). Aplicaciones: El análisis de fragmentos del punto final de PCR en el cual el tamaño de los fragmentos sea ligeramente diferentes.

Preparación del gel de agarosa Sellar con cinta adhesiva el contorno de la bandeja de gel, colocar el peine. Pesar 0.42g de agarosa en un matraz Erlenmeyer, añadir 35 mL de buffer TAE 1X. Tapar con algodón y calentar en microondas hasta que la agarosa se disuelva bien o 1 a 3 min. Una vez que la temperatura sea entre 45 y 60°C, añadir 2 μL de bromuro de etidio. Depositar el gel en la bandeja de la cámara y dejar polimerizar. Quitar la cinta adhesiva y colocar la bandeja en la cámara de electroforesis. Añadir el amortiguador TAE.

Preparación y cargado de muestras

Etiquetar 4 tubos de microfuga E, P, R1 y R2 Reactivos Estándar (E) Plásmido sin digerir (P) Plásmido digerido con una enzima (R1) Plásmido digerido con dos enzimas (R2) Muestra - Amortiguador de la muestra Centrifugar por 3 seg

Cargado de muestras Colocar tapa Aplicar 80 V De 30-40 min

Detección de las bandas: Colocar gel sobre un transiluminador, encender la lámpara de UV Visualizar bandas de DNA Tomar fotografía Determinar el peso molecular de las bandas

Std de peso molecular: Lambda HindIII Ladder λ HindIII DNA Ladder se preparar por restricción del fago seguido de la inactivación de la enzima. Los 7 fragmentos 564 base pairs a 23.13 kilobases. 564, 2027, 2322, 4361, 6557, 9416, 23130 bp

Gel modelo Std de peso molecular Sin restringir Sin muestra 1 2 3 4 5 6 T Std de peso molecular Sin restringir Sin muestra Restringido con 2 enzimas Restringido con 2 enzimas e incubado toda la noche Restringido 1 enzima VR P Inserto RNA T= topoisómeros; P= plásmido vacío (5310); VR= vector+inserto (6500 pb), Inserto 1190

Bibliografía Lizcano Losada F.; Fundamentos moleculares en medicina. El manual moderno, España, 2005. p 41-43. Mendoza DF. Practicas de Laboratorio de Biologia Molecular: Su Aplicación en Genetica Básica. Editorial de Universidad del Rosario, Colombia, 2010. p 58-62 Luque Cabrera J. Texto ilustrado de biología molecular e ingeniería genética. Elsevier, España, 2001. p 138.