Introducción al estudio de la Biología Celular y Molecular Prof. Dr Gabriel Scicolone Departamento de Histología, Biología Celular, Embriología y Genética de la Facultad de Medicina de la UBA

Cuál es el objetivo de la asignatura Biología Celular y Molecular? La Biología Celular y Molecular aporta los conocimientos referentes a la estructura, el ciclo vital y la función de la célula, que es la unidad anátomo-funcional de los organismos vivientes. En la Carrera de Medicina, esta asignatura hace hincapié en el estudio de la célula eucarionte como unidad anátomo-funcional de organismos pluricelulares en los cuales las células interaccionan coordinadamente para mantener la vida del organismo. Específicamente se trata de obtener conocimientos referentes al ser humano, pero la mayor parte de los mismos provienen de investigaciones realizadas en otros organismos que sirven de modelos de experimentación. De esta forma, la Biología Celular y Molecular constituye la base y el fundamento de la mayor parte del conocimiento médico y el avance actual en el campo de la Biología Molecular la ha constituido en una ciencia de utilidad fundamental para que el médico, cualquiera sea su especialidad, comprenda la fisiología, fisiopatología y las bases de la terapéutica. El conocimiento de esta ciencia es de importancia fundamental para comprender 1) La estructura del organismo humano a nivel macroscópico (Anatomía) y microscópico (Histología) comprendiendo cómo los distintos tipos celulares y la matriz extracelular constituyen los tejidos y cómo éstos se organizan para formar los órganos que forman parte de los aparatos y sistemas del organismo. 2) Se desarrolla el organismo humano a partir de una única célula huevo que se ha formado por la fusión de las gametas (Embriología). 3) Las bases celulares y moleculares de la herencia de los rasgos (Genética).

El cuerpo humano está formado por más de doscientos tipos distintos de células, todas ellas provienen de una única célula por sucesivas divisiones y por procesos de diferenciación celular. Todas las células tienen la misma información genética, por tanto la diferente estructura y función que cada una cumple, depende de la activación y silenciamiento de distintos conjuntos de genes y todo esto depende en gran medida de las señales que la célula recibe de su entorno. La complejidad de nuestro cuerpo depende de la diferente función que cada tipo celular tiene. Entre las células existe matriz extracelular que es el resultado de la secreción de las propias células. El organismo humano

Todas las células del cuerpo humano surgen a partir de una única célula huevo (que se origina por la fecundación de un ovocito por un espermatozoide), seguida de procesos de división mitótica y posterior diferenciación. De la célula huevo, al dividirse mitóticamente surgen dos células iguales, pero que tienen zonas particularmente diferentes (zona en contacto con la otra célula y zona de contacto con el medio ambiente). Al volver a dividirse éstas, surgen ahora 4 células equivalentes, cada una con zonas bien diferenciadas. Al volver a dividirse en sucesivas divisiones mitóticas se va formando una masa de células (mórula), donde las células ya no son todas equivalentes. Unas células se volverán a dividir a una velocidad mayor que otras, se formarán cavidades, estructuras. Como vemos la funcionalidad de una célula depende de su composición pero también de su relación con su microambiente, dentro del cual se encuentran las otras células del organismo.

Sucesivas divisiones mitóticas: Células iguales, amplificación del número de células Proceso de diferenciación celular Células enteroendócrinas Células epiteliales absortivas Célula secretora Una célula madre da lugar a otra célula madre y a una célula diferente

Todas las células del cuerpo humano están relacionadas entre sí directa o indirectamente, por lo que analizaremos las células como componentes fundamentales a partir de las cuales se organizan los tejidos, éstos conforman los distintos órganos que están funcionalmente relacionados en los diferentes aparatos, y existen además sistemas que permiten la adecuada señalización e interacción entre las distintas partes del cuerpo.

Se define a la célula como la unidad anatómica y funcional de todo ser vivo. O sea que la célula es capaz de realizar todas las funciones básicas, que son: Autorreplicarse, ya que poseen la información genética. Realizan la síntesis de macromoléculas para su propia organización estructural. Sintetizan y secretan moléculas que le permiten interaccionar con el medio. Reciben señales del medio ambiente y las procesan. Son capaces de obtener la energía para sus procesos vitales. Digieren sustancias que toman del medio ambiente o sus propios componentes. La célula eucarionte

La célula eucarionte es el elemento fundamental del cuerpo humano, está constituída por un núcleo y un citoplasma rodeado de una membrana plasmática. La característica principal de toda célula eucarionte es su compartimentalización. Los distintos organoides del citoplasma tienen una composición química, una estructura y una distribución espacial especial.

Célula eucarionte Compartimentalización

CICLO CELULAR

Dogma central de la biología molecular La información contenida en el ADN se expresa dando lugar a proteínas, mediante los procesos de transcripción, paso por el que la información se transfiere a una molécula de ARN mensajero (ARN-m) y, mediante el proceso de la traducción el mensaje transportado por el ARN-m se traduce a proteína.

EXPRESIÓN GENÉTICA Y SU REGULACIÓN DNA Transcritp de ARN RNAm Degradación del RNAm RNAm inactivo Control de Traducción proteína Proteína inactiva Control de actividad proteica Transporte de RNA y control de localización Control de procesamiento del RNA Control transcripcional Citosol Núcleo

Mitocondria Cresta Matriz Membrana interna Membrana externa Espacio intermembranoso ADN desnudo (matriz) Mitorribosomas (matriz) Fosf. Oxidativa, ATP Síntesis de proteínas mitocondriales Duplicación Transcripción Traduccion METABOLISMO

Respiracion celular, formación de ATP Fosforilación oxidativa. Oxigeno (O 2 ) Por difusión sale al citosol Por difusión entra a la mitocondria Membrana interna, se genera ATP

Las mitocondrias tienen una forma alargada de tamaño variable, diámetro entre 0,5 a 10µm. La distribución y el número de crestas varía según el tipo celular. La ubicación de las mitocondrias en las distintas células es variable, según la función celular predominante. Ej. Distribución alrededor de los canalículos en las células parietales del estomago

El Espermatozoide es una célula en que las mitocondrias se ubican en la pieza media rodeando al axonema, tal como se ve en el esquema:

Peroxisomas Contienen enzimas que participan en el metabolismo energético, por reacciones oxidativas generan peróxido de hidrógeno Sus enzimas se sintetizan en el citosol en polirribosomas libres. La membrana deriva del Retículo Endoplasmático. Se forman nuevos peroxisomas por división de los antiguos

El tamaño de las células del cuerpo humano varía entre amplios límites, las más pequeñas de 4 μm de diámetro (células grano del cerebelo) y las más grandes de 250 μm de diámetro (ovocito). DIVERSIDAD DE LOS TIPOS CELULARES EN LOS ORGANISMOS PLURICELULARES

La forma de las células del cuerpo humano también es muy variada: esferoidales, totalmente simétricas como el linfocito (núcleo central, organelas igualmente distribuídas, membrana plasmática sin variaciones en toda su superficie) cilíndricas con marcada polaridad celular como la célula del epitelio intestinal (núcleo en el tercio basal, distribución diferencial de sus organoides, diferenciaciones de membrana según sea apical o laterobasal) células absolutamente asimétricas con un cuerpo o soma estrellado con diferentes tipos de ramificaciones como las neuronas de Purkinje.

fibroblasto Capilar sanguíneo Fibras proteicas Sustancia amorfa En otros tejidos como el tejido conectivo, las células interaccionan con gran cantidad de matriz extracelular que ellas mismas generan Hay tejidos en que las células que lo componen están muy relacionadas y hay poca sustancia intercelular (tejido epitelial). Célula epitelial Célula cilíndrica Célula plana Célula fusiforme Elementos formes: glóbulos rojos Matriz extracelular = sustancia amorfa y fibras proteicas

Cuál es la composición química de la célula y cómo se organizan esos componentes para que tengan una estructura determinada y un tamaño dado. El cuerpo humano y por ende sus células constituyentes tienen las mismas propiedades de todo ser vivo

Niveles de organización de la materia Las propiedades de los seres vivos resultan de una serie de niveles de organización integrados SUB-ATÓMICO ATÓMICO MOLECULAR MACROMOLECULAR MACROMOLECULAR COMPLEJO CELULAR TISULAR ÓRGANOS SISTEMAS DE ÓRGANOS COMPLEJIDADCOMPLEJIDAD En cada nivel aparecen nuevas propiedades (‘propiedades emergentes’), que constituyen un salto cualitativo respecto del nivel anterior... En ese sentido, entendemos a la vida biológica como un conjunto de propiedades emergentes a partir del nivel de organización celular.

SUB-ATÓMICO ATÓMICO MOLECULAR MACROMOLECULAR MACROMOLECULAR COMPLEJO CELULAR TISULAR ÓRGANOS SISTEMAS DE ÓRGANOS COMPLEJIDADCOMPLEJIDAD... 1 mm10 -3 m 1 μm10 -6 m 1 nm10 -9 m m1 Å Las estructuras de los niveles más bajos tienen dimensiones muy pequeñas por eso se utilizan las siguientes unidades métricas...

Recordar que: Ejemplos en el hombre (diámetro aproximado) ______________________________________________________________________ 1cm= 0,01 m globo ocular : 2,5 cm 1mm = 0,001 m = 0,1 cm grosor del pelo: 0,07 mm ovocito maduro: 0,25 mm 1µm = 0,001 mm = m eritrocito: 7,5 µm mitocondria: entre 0,5-10 µm 1nm=0,001 µm = m microtúbulo: 25 nm microfilamento: 5 nm 1Å = 0,1 nm= m grosor de la membrana plasmática: 75 Å

Los componentes orgánicos de las células Tanto las células procariontes como eucariontes están formadas por Biomoléculas 1- Hidratos de Carbono 2- Lípidos 3- Proteínas 4- Ácidos Nucleicos

Los componentes orgánicos de las células Biomoléculas 1- Hidratos de Carbono ribosa glucosa Monosacáridos Isómeros Derivados de azúcares

Los componentes orgánicos de las células Biomoléculas 1- Hidratos de Carbono Disacáridos

Los componentes orgánicos de las células Biomoléculas 1- Hidratos de Carbono Polisacáridos

Los componentes orgánicos de las células Biomoléculas 1- Hidratos de Carbono 2- Lípidos Ácidos grasos saturados insaturados

Los componentes orgánicos de las células Biomoléculas 1- Hidratos de Carbono 2- Lípidos Fosfolípidos fosfatidilcolina Esteroides

Los componentes orgánicos de las células Biomoléculas 1- Hidratos de Carbono 2- Lípidos 3- Proteínas aminoácido polipéptido

Los componentes orgánicos de las células Biomoléculas 1- Hidratos de Carbono 2- Lípidos 3- Proteínas Su función depende de su forma tridimensional

Membrana plasmatica: asimetrica, H de C del lado externo.

Los componentes orgánicos de las células Biomoléculas 1- Hidratos de Carbono 2- Lípidos3- Proteínas 4- Ácidos Nucleicos Nucleótido puede ser

ADN versus ARN Estructura química del ARN (Fosfato-az ú car-base nitrogenada) 4- Ácidos Nucleicos

El ARN adopta estructuras tridimensionales 4- Ácidos Nucleicos

Biomoléculas 1- Hidratos de Carbono 2- Lípidos3- Proteínas ADN Los componentes orgánicos de las células 4- Ácidos Nucleicos

Nivel de Organización Celular PROCARIOTAS EUCARIOTAS Los tres dominios del mundo viviente

Cómo se estudian las células? Modelos experimentales Todas las células comparten propiedades que se conservaron a través de la evolución. Todas utilizan ADN como material genético, están rodeadas por una membrana plasmática y usan los mismos mecanismos básicos para el metabolismo energético. Los organismos se pueden clasificar en unicelulares ( bacterias, amebas y levaduras) y pluricelulares (en los que los distintos tipos de células funcionan coordinadamente cumpliendo cada una funciones particulares). Diversos tipos de células y organismos son utilizados para estudiar diferentes aspectos de la biología celular y molecular; existiendo modelos experimentales que permiten estudiar diferentes características. Podemos dividir a las células en dos tipos principales: Procariontes y Eucariontes.

Célula procariótica típica Escherichia Coli (está habitualmente en el tracto intestinal humano), es el modelo experimental ideal para estudiar mecanismos de biología molecular y bioquímica incluídos los estudios genéticos. Pared celular (polisacáridos, péptidos, porosa) Membrana Plasmática (bicapa fosfolipídica, proteínas asociadas, verdadera separación funcional entre interior y exterior celular) Citoplasma (es el protoplasma celular, de apariencia granular por la presencia de ribosomas) ADN circular (molécula única)

Célula eucariótica Membrana plasmática Citoplasma (citosol con citoesqueleto y sistema de endomembranas). Entre los orgánulos dependiente del sistema de endomembranas : Envoltura núclear (Varias copias de ADN) Aparato de Golgi Lisosomas REL RER Vacuolas Mitocondrias Peroxisomas La célula eucariótica más simple es la levadura, utilizada como modelo experimental de célula eucariótica.

Modelos para estudiar organismos multicelulares El nematodo C. Elegans, se utiliza para estudios de desarrollo y diferenciación celular. La mosca de la fruta, Drosophila Melanogaster, modelo para el estudio de los mecanismos moleculares del desarrollo por su fácil reproducibilidad.

Xenopus laevis, modelo para el estudio del desarrollo embrionario Pez cebra, modelo para estudios genéticos del desarrollo de los vertebrado

Los embriones de aves permiten realizar estudios acerca de los mecanismos moleculares del desarrollo in vivo (fácil acceso)

El ratón y la rata como modelos del desarrollo humano Estudios de comportamiento, estudios del sistema nervioso, respuestas a fármacos. Además algunas alteraciones genéticas dan lugar a defectos del desarrollo similares a los humanos. Rata realizando una Prueba conductual Operación cesárea para Estudiar al feto ControlEtanol Estudios de alcoholismo maternofetal

Estudios in vivo. Estudios in vitro (cultivos celulares). Estudios libres de células.

Instrumentos de la Biología Celular Lupa y Microscopio óptico Microscopio electrónico Homogeinizador, Centrífuga y ultracentrífuga. Agitador Cámaras de cultivo, Estufas Termociclador Cuba electroforética

Microscopio optico Limite de resolución del MO es 0,2 µm, es la distancia mínima de separación de dos objetos para verlos como distintos. Este valor depende de dos factores: longitud de onda de la luz visible y la apertura numérica de la lente. Tener en cuenta que: 1µm=0,001mm=10 -6 m y que: LR= 0,61 λ÷ AN Siendo AN=ŋsenα ŋ es el índice de refracción del medio que está entre el objetivo y el preparado α es el ángulo del cono de luz que entra al objetivo Pedí al docente del TP de histo que te muestre donde figura la AN del microscopio con el que estás trabajando Lente objetivo Luz

Tipos de MO MO de campo claro, la luz visible atraviesa el preparado, es necesario teñir las células para poder verlas, no son apropiados para ver células vivas. MO de contraste de fase y de interferencia, utilizan sistemas ópticos que convierten variaciones de densidad o grosor en diferentes contrastes, son útiles para ver células vivas sin teñir. Luz visible A- campo claro B- interferencia C- contraste de fase Preparado tejido fijado y teñido Preparado sin teñir- células vivas

MO de epifluorescencia, se utiliza una tinción fluorescente que absorbe a una longitud de onda y emite en otra, se utilizan filtros especiales para cada long de onda.

MO confocal, combina la microscopía fluorescente con el análisis en distintos planos del objeto para obtener imágenes tridimensionales.

MO de excitación por dos fotones, imágenes tridimensionales de células vivas.

Microscopios electrónicos Microscopio Electrónico de Transmisión, MET, el haz de electrones atraviesa la muestra fijada y contrastada con metales pesados. Existe tinción positiva y tinción negativa. Por el desvío del haz de electrones, en la pantalla fluorescente habrá una gama de grises, el LR= 0,2nm=2Å Microscopio Electrónico de Barrido o Scanning, MEB, se utiliza para obtener imágenes tridimensionales de las células. El haz de electrones no atraviesa la muestra, la célula se cubre con un metal pesado y los electrones se recogen generando la imagen tridimensional.

Microscopía electrónica de transmisión Tinción positiva Tinción negativa Sombreado metàlico Congelación-fractura

Fotomicroscopio óptico Diferencias entre ME y ME: El ME utiliza un haz de electrones en lugar de luz visible o fotones. La resolución es mayor, o sea es menor el Límite de resolución ya que la longitud de onda de los electrones es mucho menor. Utiliza lentes electromagnéticas para centrar el haz de electrones. MET

MO: Inclusiones en parafina MET: Inclusiones en resinas epoxi La preparación del material es diferente. Distintos fijadores y distintas inclusiones Portaobjetos con preparado Grillas con cortes Estudios in vivo.

ULTRAMICROTOMO MICROTOMO Distintos equipos para realizar los cortes

Microscopía ópticaMicroscopía electrónica Vibrátomo Crióstato Taco Cuchilla de vidrio Ultramicrótomo

Microscopía ópticaMicroscopía electrónica Taco Cuchilla de vidrio Ultramicrótomo Micrótomo rotatorio tipo Minot

Microscopía ópticaMicroscopía electrónica Portaobjetos de vidrio Grillas de cobre

Cultivos celulares Camara de seguridad biologica, flujo laminar: allí se realiza la Siembra. Estufa gaseada mantenimiento del cultivo Estudios in vitro

La ciencia avanza… GFP – Proteína verde fluorescente Aislada de Aequorea victoria por Osamo Shimomura en 1962 En 1994, el laboratorio del Dr Chalfie publica la expresión de esta proteína en la especie C. elegans En 2008, Martin Chalfie, Osamu Shimomura y Rogen Tsien obtienen el Premio Nobel de Química por su descubrimiento y desarrollo de la proteína verde fluorescente. Actualmente, es usada como un reportador de la expresión de diferentes genes.

Fraccionamiento subcelular Conjunto de métodos y técnicas que tienen como objetivo obtener fracciones puras o enriquecidas de un determinado componente celular. ETAPAS 1- Ruptura de las células Sonicación. Consiste en la aplicación de ultrasonidos a una suspensión celular. La intensa agitación producida destruye las membranas celulares. Uso de detergentes que solubilizan las membranas celulares. Homogenizadores. Se rompen las células con la ayuda de un émbolo rotatorio que se ajusta perfectamente a las gruesas paredes de un tubo de cristal especial. homogenato celular núcleos mitocondrias microsomas ribosomas citosol Estudios libres de células.

vacíorefrigeración Fraccionamiento subcelular ETAPAS 2- Separación de componentes La separación de partículas u organelas que no presentan una tendencia a sedimentar espontáneamente, requiere aumentar la fuerza gravitatoria a través de la centrifugación. Centrifugación

Fraccionamiento subcelular ETAPAS 2- Separación de componentes centrífuga rotor

Fraccionamiento subcelular ETAPAS 2- Separación de componentes La velocidad de sedimentación de cada partícula  es proporcional a su tamaño,  es proporcional a la densidad de la partícula  aumenta al incrementarse la fuerza gravitatoria Centrifugación diferencial Mediante centrifugaciones correlativas y crecientes en velocidad, se logran separar los principales componentes celulares sobrenadante sedimento o ‘pellet’

Fraccionamiento subcelular homogenato pellet: células enteras, núcleos g 10’ g 20’ g 1h g 3h pellet: mitocondrias, lisosomas, peroxisomas pellet: microsomas pellet: ribosomas, grandes macromoléculas por centrifugación diferencial sobrenadante: citosol

Separación de organoides por Gradiente de Sacarosa

Fraccionamiento subcelular por centrifugación diferencial ¿Cómo se confirma el ‘éxito’ de la técnica? Determinando actividades enzimáticas específicas de una organela Verificando la morfología mediante microscopía electrónica

Microfotografía electrónica de un pellet correspondiente a la fracción nuclear Microfotografía electrónica de un pellet correspondiente a la fracción microsomal

Por centrifugación por gradientes de sacarosa se separó las terminaciones nerviosas o sinaptosomas

Centrifugación en gradiente de densidad