Juan Manuel Debernardi RT-qPCR: uso de rutina DISEÑO, EJECUCIÓN Y REPORTE DE EXPERIMENTOS DE RETROTRANSCRIPCIÓN SEGUIDA DE REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA CUANTITATIVA EN TIEMPO REAL (RT QPCR)

Control de la expresión génica por miARNs en plantas Modelo de trabajo: Arabidopsis thaliana

Sistema regulatorio miR396 – GRFs (Growth Regulating Factors)

La RT-qPCR es una técnica cuantitativa sometida a múltiples etapas donde se puede introducir error. 1) Obtener el ARN de la muestra a analizar. Colecta del material Purificación del ARN 2) Tratamiento con DNAsa para eliminar el ADN genómico. 3) Retro Transcripción. 4) Real-time PCR. Protocolos para RT-qPCR establecidos  Que etapas son críticas Problemas comunes: Gran dispersión en los valores de Ct: Falta de reproducibilidad en replicas técnicas y biológicas. Tubos donde no hay amplificación Contaminaciones Amplificación del gen PP2A (calibrador) Como realizar una buena RT-qPCR

El procedimiento de extracción y purificación debe permitir obtener el ARN total en las siguientes condiciones: No degradado. Libre de nucleasas. Libre de ADN genómico. Libre de proteínas. Libre de inhibifores enzimáticos, para reacciones de RT y PCR. Libre de Mg2+ or Mn2+. DNAsa Retro transcripción Real-time PCR Obtener el ARN de la muestra a analizar Obtener el ARN Colecta del material Purificación del ARN

1) Cuanto material necesito para la RT? Para una RT-qPCR es suficiente con poco material (≈50mg) 2) Cómo hago la colecta?. Colecta en hielo – procesado de tejido fresco. + comodidad, - estabilidad de la muestra (contenido de agua de la misma).. Colecta directamente en N 2. + estabilidad de la muestra, - comodidad. OJO: Efectos de la congelación de tejido / descongelación sobre la calidad del ARN. Colecta en RNAlater. +estabilidad de la muestra, + comodidad, - costo. DNAsa Retro transcripción Real-time PCR Colecta del material Obtener el ARN de la muestra a analizar Obtener el ARN

. Métodos comerciales basados en purificación en columna con filtros de Silica-fibra de vidrio. RNeasy Mini Kit (Qiagen) GeneJET™ RNA Purification Kit (Fermentas). PureLink® RNA Mini Kit (Ambion) mirVana™ Kit(Ambion). Métodos basados en extracción química: One-step sample homogenization/lysis procedure with a phenol-based guanidinium solution (Chomczynski, 1987). Trizol, Tripure. Durante la homogeneización de la muestra, mantiene la integridad del ARN debido a la inhibición altamente eficaz de la actividad RNasa mientras disgrega las células y disuelve los componentes celulares. DNAsa Retro transcripción Real-time PCR Purificación del ARN Obtener el ARN de la muestra a analizar Obtener el ARN

I) Homogenización: a.- Morterear el material en N 2 en el eppendorf con pilón (previamente enfriado). b.- Agregar 1 ml de Trizol para un máximo de 100 mg de tejido. Importante: una cantidad insuficiente de reactivo resulta en contaminación con ADN y proteina (<260/280). En este punto se puede conservar el homogenado a -80 °C hasta 1 mes. c.- Centrifugar a g a 4 °C 10 minutos y transferir el homogenado a un nuevo tubo. DNAsa Retro transcripción Real-time PCR Purificación del ARN Obtener el ARN de la muestra a analizar Métodos basados en extracción química: Trizol, Tripure Obtener el ARN

II)Separación: d.- Agregar 200 μl de cloroformo por cada ml de reactivo original, invertir vigorosamente por 15 seg, y centrifugar a g a 4 °C 15 minutos. e.- Pasar la fase superior a un nuevo tubo. El volumen de la fase acuosa representa ≈ 50% del volumen utilizado para la homogenización. Importante: evitar tomar de la interfase o de la fase orgánica (<260/280 y <260/230). Para estar seguro tomo 350 μl. Se generan 3 fases, la inferior (fenol/cloroformo), la interfase, y la fase superior acuosa que contiene el RNA. DNAsa Retro transcripción Real-time PCR Purificación del ARN Obtener el ARN de la muestra a analizar Métodos basados en extracción química: Trizol, Tripure Obtener el ARN

III) Precipitación del RNA: Existen diferentes protocolos de precipitación dependiendo de la calidad del ARN que deseamos. f.-Para precipitar ARN total (ARNm, ARNr, ARN pequeños): Agregar un volumen igual de isopropanol, en este caso 350 μl e incubar 2hr a - 20°C (OL). Dado que la precipitación de los ARNs pequeños depende fuertemente de las condiciones, es importante mantener esta relación. g.- Centrifugar g a 4 °C 10 minutos, descartar el sobrenadante. DNAsa Retro transcripción Real-time PCR Purificación del ARN Obtener el ARN de la muestra a analizar Métodos basados en extracción química: Trizol, Tripure Obtener el ARN

IV) Lavado: h.- Agregar 1 ml de etanol %, frío, vortexear y centrifugar 7500 g a 4 °C 5 minutos. i.- Descartar el SN. Repetir el lavado con etanol y centrifugación. Descartar SN. V) Disolución del RNA: j.- Secar el pellet en estufa 37 °C por 10 min y resuspender en agua (calidad ARN). No dejar el pellet secar completamente. DNAsa Retro transcripción Real-time PCR Purificación del ARN Obtener el ARN de la muestra a analizar Métodos basados en extracción química: Trizol, Tripure Obtener el ARN

Medida de la concentración del RNA por espectrofotómetro UV a 260nm.. Relación 260/280≥ 2. Contaminación con proteína. Cantidad de reactivo ( trizol, tripure ) y toma de fase acuosa.. Relación 260/230. Microarrays se tolera hasta 1,5, y en RT-qPCR hasta 1. Contaminación con tiocianto de guanidinio Toma de fase acuosa. Chequeo de la integridad del RNA. 5 ug de ARN en 20 ul finales. Calentar 5 min a 65°C para romper estructura secundaria.. Llevar rápidamente a hielo y correr un gel de agarosa al 1,5 %. Relación 28S:18S debería estar entre 1.8 and 2.0, con baja cantidad de fragmentos chicos. Purificación del ARN Obtener el ARN de la muestra a analizar Métodos basados en extracción química: Trizol, Tripure Obtener el ARN DNAsa Retro transcripción Real-time PCR

- Condición de reacción (Vf:20 μl; completar con agua):. Buffer DNasa 2 μl. DNasa (Promega) 1 μl. ARN (0,5 a 1ug) Esta cantidad es suficiente y ayuda a no arrastrar potenciales impurezas que inhiban la RT. Punto importante para tener baja dispersión en valores de Ct en la qPCR. Hacer dilución del ARN llevando a aproximadamente 100ng/ul. (pipeteo entre 5-10 μl utilizando una p20) La idea es no tomar volúmenes chicos que introducen mucha variación. Obtener el ARN DNAsa Retro transcripción Real-time PCR Tratamiento del ARN con DNAsa – Etapa crítica No existe método de purificación que permita obtener ARN completamente libre de ADN genómico.

Obtener el ARN DNAsa Retro transcripción Real-time PCR -Incubar 30 minutos a 37 °C Controles para evitar contaminaciones con productos de qPCR previas. A partir de este punto lo ideal es continuar en todos los pasos con un juego de pipetas exclusivas de RT-qPCR o utilizar tips con filtro. - Agregar 1 μl de “DNasa Stop Solution (EDTA)” e incubar 10 minutos a 65 °C. Si no se remueven los cationes divalentes el ARN se degrada al calentarlo en las etapas posteriores de la RT. Tratamiento del ARN con DNAsa – Etapa crítica

a.- Preparar la siguiente mezcla:. Oligo(dTV) 0,5 μg/μl 0,5 μl (oligo especifico, SLO, etc). dNTP mix 10 mM 1 μl. Agua csp 13,5 μl ARN (tratado con DNAsa)10 μl (precisión en el pipeteo) b.- Calentar a 65 °C durante 5 minutos e incubar en hielo al menos 1 minuto. c.- Spin down e.- Preparar la siguiente mezcla: 5X First Strand Buffer 4 μl DTT 0,1 M 1 μl Inhibidor de RNasa (Invitrogen) 1 μl SuperScript III 0,5 μl Agregar la mezcla al ARN y mezclar por inversión de los tubos. f.- Incubar 60 minutos a 50 °C e inactivar la reacción 15 minutos a 70 °C Síntesis del ADNc – Retro transcripción Obtener el ARN DNAsa Retro transcripción Real-time PCR Siempre que se pueda, preparar mix. Evitar mezclar por pipeteo. Si es posible trabajar con un juego de pipetas y reactivos exclusivos de RT-qPCR.

a.- Realizar una dilución 1/10 de cDNA. (precisión en el pipeteo, evitar hacer la dilución con volúmenes chicos de cDNA, preferentemente usar > 5-10ul) Convenientemente preparar solo la cantidad necesaria para el experimento. El resto guardar a -20°C. b.- Realizar diluciones de los oligos que se van a utilizar. Prepara una mezcla 5μM del par de oligos, mezclando 10ul de cada uno (100μM) con 180 ul de agua. Real-Time PCR Obtener el ARN DNAsa Retro transcripción Real-time PCR Diseño de los oligos y condiciones de la PCR. Evitar mezclar por pipeteo. Si es posible trabajar con un juego de pipetas y reactivos exclusivas de RT-qPCR. Trabajar rápido – Protocolo de pipeteo.

c.- Preparar la siguiente mezcla y alicuotar en tubos: Agua6,5 μl Buffer 10X2 μl Cl 2 Mg 50mM1,2 μl dNTPs 10mM0,4 μl SYBR green 10X0,8 μl Platinum-Taq0,1 μl Mezclar bien por inversión d.- Agregar en las paredes del tubo: cDNA5 μl, este volumen ayudar a reducir el error Mezcla Oligos 5μM4 μl Cerrar los tubos y dar un spin. Real-Time PCR Obtener el ARN DNAsa Retro transcripción Real-time PCR Diseño de los oligos y condiciones de la PCR. Evitar mezclar por pipeteo. Si es posible trabajar con un juego de pipetas y reactivos exclusivas de RT-qPCR. Trabajar rápido – Protocolo de pipeteo. Evitar sembrar los productos de las PCR en el mismo laboratorio

Obtener el ARN DNAsa Retro transcripción Real-time PCR ProblemaError común Degradación Abs 260/280 < 2 Abs 260/230 < 1 No amplificación Imprecisión en el pipeteoDispersión en los valores de ct Imprecisión en el pipeteoDispersión en los valores de ct Reactivos/pipetas contaminadosAmplificación en controles negativos Imprecisión en el pipeteoDispersión en los valores de ct Reactivos/pipetas contaminadosAmplificación en controles negativos Mezcla de la mixDispersión en los valores de ct Resumen

Ejemplo. Amplificación del gen PP2A Problemas en amplificación Dispersión en los valores de ct