Desarrollo y optimización de un sensor óptico para cuantificación y control de calidad de soluciones de anticuerpos monoclonales Olga Rubio.

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1 Desarrollo y optimización de un sensor óptico para cuantificación y control de calidad de soluciones de anticuerpos monoclonales Olga Rubio

2 Sistema Inmune Sistema inmune: conjunto de elementos especiales de un organismo, que le permite defender su integridad biológica frente a agresiones esencialmente externas (virus, bacterias, hongos, etc.)  estímulo antigénico Anticuerpos (Ac) o inmunoglobulinas (Ig): proteínas producidas en respuesta a la inmunización del organismo con antígenos (Ag) Cada Ac reacciona específicamente contra el mismo antígeno que indujo su formación.

3 Antígenos (Ag) y Anticuerpos (Ac)
Los Ac se unen a los Ag por sitios llamados paratopes En los mamíferos se distinguen 5 Ac: IgM, IgA, IgG, IgD e IgE que difieren en tamaño y propiedades. Los Ag son estructuras complejas cuyas superficies tienen diversos sitios que reconocen cada uno un Ac específico. Estas zonas se llaman epitopes o determinantes antigénicos pudiendo cada una, unirse a un Ac diferente.

4 Estructura del anticuerpo
Las cadenas se unen por puentes disulfuro. Las cuatro poseen una parte constante y una variable. Las zonas variables, tanto de la cadena L como H, poseen a su vez regiones en las que se concentra la variabilidad: tres segmentos que forman las llamadas regiones hipervariables o CDR

5 Anticuerpos monoclonales (AcMo)
Cuando se realiza una inmunización con el objeto de producir anticuerpos frente a un antígeno, se produce gran variedad de inmunoglobulinas (Ac policlonales) que poseen función de Ac frente a diferentes epitopes del antígeno. Los anticuerpos monoclonales son reactivos biológicos homogéneos en su actividad, en contraste con los antisueros convencionales (policlonales) que son una mezcla variable de inmunoglobulinas.

6 Uso de los AcMo Caracterización y cuantificación de sustancias de interés biológico que se encuentran en cantidades muy pequeñas (hormonas, interferones, etc.) Identificación de antígenos presentes en las membranas celulares. En los trasplantes de órganos: los AcMo dirigidos contra los linfocitos T, se utilizan en casos de amenaza de rechazo agudo. En Oncología para la localización de células tumorales y/o su destrucción. En la detección de grupos sanguíneos y estudios de fenotipo.

7 Interacción Ag-Ac La zona por donde se unen Ag y Ac se encuentra a nivel de los puentes disulfuro intercatenarios de la molécula de Ac. (Zona Bisagra) Los Ac se unen por enlaces no covalentes a los epitopes de los Ag en sus sitios activos también llamados paratopes.

8 Características de la unión Ag-Ac
Especificidad de la unión Ag-Ac: un Ac se une fundamentalmente a un Ag determinado. Afinidad: Interacción físico-química precisa entre el sitio de combinación de un Ac y un Ag. Se expresa a través de la constante de asociación. ka y kd son las velocidades de asociación y disociación. Avidez: fuerza total que considera todas las interacciones epitope/paratope que tienen lugar entre un Ag complejo y Ac multivalentes.

9 Adsorción de biomoléculas en solución a superficies sólidas
Es la fijación a la superficie de un sólido, de moléculas, átomos, o iones (adsorbato), por ejemplo los que se encuentran en una solución puesta en contacto directo con esa superficie. El proceso inverso se llama desorción. Es resultado de la atracción entre las moléculas de la superficie del sólido adsorbente y el adsorbato.

10 Quimisorción y Fisisorción
Experimentalmente se encuentran dos órdenes de magnitud diferentes para la atracción que produce la adsorción, indicando dos formas en que las moléculas se pegan a las superficies Fisisorción o Adsorción física Interacciones débiles: Van Der Waals, de atracción electrostática o atracciones dipolares entre sitios de la superficie y moléculas adsorbidas. Barreras del orden 0.3 a 1 kcal/mol. Tiempo de adsorción de ms a ms Quimisorción o Adsorción química Moléculas adsorbidas a la superficie como resultado de la formación de un enlace químico (muy fuerte comparado con las fuerzas de ligadura en la fisisorción) Tiempo de adsorción de s a hs

11 Modelo de adsorción de Langmuir
Todos los sitios de la superficie son independientes, equivalentes, distinguibles y de las dimensiones laterales de las macromoléculas adsorbidas y aisladas, las moléculas adsorbidas (adsorbato), sólo interaccionan con la superficie, las interacciones entre moléculas adsorbidas son despreciables por ser de corto alcance, el adsorbato forma una capa monomolecular sobre la superficie, las macromoléculas adsorbidas no se desplazan sobre la superficie.

12 Representación simbólica del proceso de adsorción
ka A + S AS kd Donde: A indica una molécula de adsorbato, S indica un sitio de la superficie adsorbente, AS es el complejo adsorbato-superficie, ka es la velocidad de adsorción y kd es la velocidad de desorción.

13 Factor de Recubrimiento
Fracción ocupada del total de sitios donde: N es la cantidad total de sitios de adsorción X cantidad de sitios ocupados por moléculas adsorbidas

14 Variación del recubrimiento
La adsorción y desorción sobre el sustrato, ocurren simultáneamente en distintos puntos del mismo La velocidad de adsorción de las moléculas a la interface es proporcional a la concentración de adsorbato en la solución, y a la fracción de sitios vacantes de la superficie : La velocidad de desorción, es proporcional a la fracción de sitios ocupados de la superficie:

15 Cinética de Langmuir Si se expresa Ca como (x,t), donde:
x : es la distancia a la superficie t : es el tiempo de exposición de la solución a la superficie, las dos variaciones vistas se resumen en una : Aquí el primer término representa la contribución al recubrimiento de la adsorción y el segundo de la desorción

16 Fenómenos coexistentes en la interacción de solución y superficie
La adsorción de moléculas a la superficie se realiza en a = (.. ka )-1 La desorción, tiene un tiempo característico d = kd -1 La difusión generada por el gradiente de ., se realiza con el tiempo característico D = L2/D Donde L es la dimensión característica de la molécula y D es su coeficiente de difusión. Según los tiempos característicos de cada fenómeno el proceso resultante tiene los siguientes casos límite:

17 Límite de difusión rápida D << a
La deposición del Ac sobre la oblea, genera un gradiente en la concentración, que produce difusión hacia la interface, manteniéndose la concentración en la superficie (0,t) en el valor promedio  resultando: donde:

18 Límite D >> a Velocidad de adsorción controlada por la difusión En este caso, la adsorción domina frente a la difusión, siendo prácticamente inmediata la deposición total del Ac, y resultando el recubrimiento, dependiente del coeficiente de difusión de la macromolécula D:  (t)   (D t)½ Para proteínas en solución, el tiempo de difusión característico, varía en forma típica entre 0,1 y 100 s.

19 Biosensores Poder de reconocimiento de los sistemas biológicos
Selectividad Sensibilidad Poder de reconocimiento de los sistemas biológicos Diseño instrumental muy simple Biosensores

20 Elementos de un biosensor
Elemento de reconocimiento molecular del analito Elemento Generador de la señal Transductor Elemento clave Integración del biosistema con el transductor Componente Biológica

21 Clasificación considerando la Componente Biológica
Sensores basados en enzimas Inmunosensores Sensores de ADN Sensores basados en receptores Biosensores de células aisladas De tejidos animales o plantas

22 Clasificación considerando el Transductor
Biosensores Potenciométricos (electrodos selectivos de iones o gases, FETs) Biosensores Amperométricos Biosensores Conductométricos Biosensores Ópticos Biosensores Potenciométricos comandables por luz Biosensores Térmicos Biosensores Piezoeléctricos

23 Los Biosensores Ópticos se basan en la medición de
Absorción de la luz Emisión de la luz Light scattering (dispersión de la luz) Fluorescencia de la luz Reflectancia

24 Inmunosensores Son biosensores que usan Ac como detector. El parámetro que se mide puede ser: electroquímico, óptico, cambios térmicos, de masa, etc. La interacción del analito con la componente biológica del biosensor es registrada por el detector integrado. Se basan en reacciones inmunoquímicas, por ejemplo la ligadura del Ag a un Ac específico. La formación de los complejos Ac-Ag debe detectarse bajo condiciones en que se hayan minimizado las interacciones no específicas.

25 Principios y Técnicas Ópticas utilizadas en Inmunosensores

26 Reflexión Total Interna - RTI
Al incidir una OEM, sobre un material rodeado por otro de menor índice de refracción, a partir de un cierto ángulo de incidencia, llamado ángulo crítico, la luz es totalmente reflejada dentro de ese material, y es "guiada" a través de este medio, sin trasmitirse luz al medio de menor índice de refracción ( fibras ópticas)

27 Onda evanescente Aunque el haz de luz que se propaga a lo largo de una fibra óptica, queda limitado a la región central de la misma, se genera una onda evanescente que penetra una d   en el medio de menor índice de refracción, atenuándose exponencialmente. La adsorción de moléculas que se realiza en este medio  cambio local del índice de refracción  cambio en las condiciones de reflexión  Estas variaciones son usadas como parámetro de medida.

28 Espectroscopía de onda evanescente
El campo electromagnético evanescente tiene una profundidad de penetración que depende de los índices de refracción de los medios y del ángulo de incidencia de la luz. Para luz visible, es del orden de 50 a 500nm. Debido a esto, un cambio en el medio de índice de refracción menor, influencia las características de la propagación.

29 Resonancia plasmónica de superficie SPR
Al incidir un haz de luz monocromática polarizada, el campo evanescente  penetra la lámina de metal  excita ondas electromagnéticas superficiales dentro de la región formada por los electrones de conducción del metal (plasmones)  las condiciones para SPR son sensibles a las variaciones de n.

30 Elipsometría

31 Elipsómetro Utilizado para determinar el cambio del estado de polarización de un haz colimado de luz monocromática polarizada, producido por la reflexión sobre una superficie pulida. Permite registrar las variaciones de la intensidad de luz reflejada por la superficie bajo diferentes ángulos de incidencia, y en diversos estados de polarización.

32 Reflexión de una OEM Al incidir una OEM monocromática no polarizada sobre una superficie reflectante, la reflectancia varía según el ángulo de incidencia, observándose un mínimo en un ángulo llamado de incidencia principal (o de Pseudo Brewster para superficies conductoras o semiconductoras). El campo E de cualquier onda incidente, se puede descomponer en dos componentes: una incluida en el plano de incidencia, o componente de polarización p y otra perpendicular al mismo o componente de polarización s.

33 Polarización por reflexión bajo ángulo de incidencia principal
OEM monocromática no polarizada, que incide bajo el ángulo de incidencia principal; la componente p se trasmite, la componente s en parte se trasmite y en parte se refleja. El rayo reflejado y el trasmitido resultan perpendiculares.

34 Onda de polarización p que incide bajo ángulo principal
OEM monocromática incidente polarización p bajo el ángulo de incidencia principal superficies dieléctricas  Rmin = 0 superficies semiconductoras o conductoras  Rmin  0 Alteración de las condiciones de la superficie  cambio en el índice de refracción de la interface  aumento en la intensidad reflejada  se puede emplear para detectar la adsorción de moléculas a la superficie.

35 Esquema del inmunosensor óptico por reflectometría láser
Haz láser incidente Haz láser reflejado Anticuerpo Aumento de Intensidad del haz láser reflejado Oblea de Silicio

36 celda -membrana - oblea
Montaje Experimental Plataforma del elipsómetro Láser 633nm Tubo Foto multiplicador Conjunto celda -membrana - oblea celda membrana Oblea de Si PC

37 Reflectancia de onda polarizada p, en incidencia bajo ángulo principal, para diferentes superficies
l = 633 nm Semiconductor: Mínimo no nulo Dieléctrico: Mínimo nulo

38 Detección de biomoléculas por reflectometría
Se basa en la medición de los cambios de reflectancia, desde una superficie puesta en contacto con dicha solución, debidos a la adsorción sobre la superficie, de biomoléculas en solución. Requisitos de la superficie: plana y homogénea índice de refracción muy diferente del de las biomoléculas (para detectar fácilmente los cambios relativos de las intensidades de luz reflejada provocados por la adsorción de dichas biomoléculas).

39 Mediciones de Intensidad Reflejada
Intensidad láser reflejada en función del tiempo y curva correspondiente al ajuste de datos gráfica corresponde al agregado de 80 g de anti-AB monoclonal a la celda

40 Cinética de adsorción de anticuerpos
(1) Realizando los reemplazos P1 = A P2 = y P3 = (1) se expresa (2)

41 Casos límite . Si t  0, (2) resulta
. Si t  , (2) tiende a Imax, resultando

42 Resultados Obtenidos

43 Ángulo de Incidencia Principal para Interface Aire-Silicio

44 Ángulo de Incidencia Principal para Interface Si-solución fisiológica

45 Curva de calibración Valores de f (C) para cada cantidad de anti-AB agregada Constante de adsorción ka = ( 7.2 ± 0.5) /g.s

46 Determinación de una concentración incógnita
Se determinan los parámetros P1, P2 y P3 y f(C) para una muestra incógnita, resultando f(C) = ( ± ) 1/s. Por interpolación sobre la curva de calibración se calcula la cantidad de AcMo adsorbido a la oblea: C ±  C = (173 ± 9) g Por método Colorimétrico se constata: *que la muestra usada contenía (180 ± 10) g de anti-AB en la celda, valor que cae dentro del entorno determinado. * la ausencia de AcMo en el sobrenadante, lo que indica que el total de proteína había sido adsorbido a la oblea.

47 Aplicación a la determinación de una concentración incógnita
f(C) = ( ± ) 1/s C ±  C = (173 ± 9) g

48 Obtención de la constante de desorción
Teniendo en cuenta que Resulta Y en base a los valores promedio de f(C) y de P3 medidos se calcula la constante de desorción de los AcMo empleados: kd = ( ± 0.03) 1/s

49 Discusión y conclusiones
Los valores de f(C) y de P3 son independientes de la intensidad incidente en la interface oblea de Si-solución fisiológica. Por lo tanto, este método resulta independiente de las características de la fuente de iluminación. Las gráficas obtenidas de I vs t son muy bien aproximadas (R>0,94) con la función de la correspondiente a la cinética de adsorción de acuerdo con el modelo de Langmuir. El método permite obtener la concentración de anticuerpo en una muestra incógnita Se pueden obtener las velocidades de adsorción y desorción del Ac a la oblea de Si No es necesario marcado de la proteína Se puede usar con mínima cantidad de proteína