Microbiología General

Presentación del tema: "Microbiología General"— Transcripción de la presentación:

1 Microbiología General
Seminario Nro. 1 Esterilización y Bioseguridad

2 Algunos conceptos básicos...
Esterilización: eliminación o muerte de todos los microorganismos que contiene un objeto o sustancia. Bactericida: Agentes que destruyen y matan a las bacterias Bacteriostático: Agentes que inhiben el crecimiento de las bacterias Desinfectante: agente que elimina la carga microbiana total en superficies inanimadas tales como mesadas de trabajo. Antiséptico: agente que controla y reduce la presencia de microorganismos potencialmente patógenos sobre piel y/o mucosas

3 Esterilización Criterio de muerte para un microorganismo
Perdida irreversible de su capacidad de reproducción

4 Cinética de Muerte de un MO
La muerte de microorganismos como consecuencia de un tratamiento a altas temperaturas sigue una cinética exponencial. Nº ufc tiempo dN dt = - K´N

5 Cinética de Muerte de un MO

6 VALOR D : Tiempo de reducción decimal
Se define el valor D como el tiempo necesario para que el número de supervivientes caiga al 10% del valor inicial (o, lo que es lo mismo, para que el logaritmo del número de supervivientes se reduzca en una unidad). El tiempo (D) varía para cada temperatura (de ahí el subíndice t) de forma que a mayores temperaturas el valor de D es menor, es diferente para distintos microorganismos, distintos entornos y diferentes condiciones fisiológicas.

7 VALOR D : Tiempo de reducción decimal

8 Efecto de la Temperatura
log nº m.o. viables tiempo 60 ºC 100 10 1 70 ºC 50 ºC ¿ A que temperatura es menor el valor de D?

9 D es un parámetro de la sensibilidad de un Microorganismo determinado al efecto de la temperatura
log nº MO viables 100 A ¿Cuál es el MO más sensible al tratamiento? 10 B 1 C tiempo

10 VALOR Z Si aumentamos la temperatura de tratamiento, el valor de D disminuye de forma logarítmica. De manera análoga a como el valor D indicaba el tiempo necesario para lograr que el número de supervivientes se redujera al 10% de la población inicial, el valor z indica el incremento en la temperatura (medida en número de grados) necesario para que el valor D se reduzca a la décima parte del inicial. donde ∆T es el incremento de temperatura, y DT1 y DT2 los valores de D a las dos temperaturas estudiadas.

11 Efecto de la Temperatura sobre características de los alimentos

12 Efecto de la carga inicial (No)

13 Esterilización en Microbiología de Alimentos
Desde el punto de vista de la salud alimentaria, se suele requerir un tratamiento 12D de los productos susceptibles de ser portadores de gérmenes patógenos (o que puedan dar lugar a intoxicaciones). Este tratamiento reduce en 12 órdenes de magnitud el número de supervivientes o bien, visto de otra forma, reduce en un factor de la probabilidad de supervivencia de un microorganismo dado. Si consideramos que un solo microorganismo contaminaba una unidad (una lata, por ejemplo) del alimento inicial, después de un tratamiento 12D la probabilidad de encontrar una lata contaminada se reduce hasta

14 Clostridium botulinum
D121 = 0.20 min No = 3.5 x 10 5 ufc/lata Tiempo de tratamiento a 121°C = 2 min NF = ¿? 3.5 x ufc/ lata

15 Probabilidad de sobrevivientes
Valor D=1 minuto Log 10 6 Recuento de viables 105 5 4 3 B 2 A 1 Probabilidad de sobrevivientes 1 2 3 Tiempo (min) 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 Log 10

16 Probabilidad de sobrevivientes
Log 10 12 Recuento de viables 10 8 MO A D=1 min a 121 ºC 6 4 2 10 8 6 12 4 2 Probabilidad de sobrevivientes 1 2 3 4 5 6 7 Tiempo (min) MO B D=0.5 min a 121 ºC Log 10

17 Ejercicios Si se ha determinado que para esporas de Clostridium botulinum suspendidas en buffer fosfato el D121 = min, ¿Cuánto tiempo llevaría reducir una población de 1012 esporas de C. botulinum en buffer fosfato a 1 espora a 121°C? Para el mismo sistema se sabe que el valor Z= 10ºC. ¿Cuánto tiempo llevaría reducir una población de 1012 esporas de C. botulinum en buffer fosfato a 1 espora a 111°C? La leche cruda a la entrada de la planta de procesamiento tiene una carga bacteriana de 4x105ufc/ml. La leche se va a procesar a 79ºC por 21 segundos. Si el valor D promedio para la población bacteriana a 65ºC es de 21 segundos y el valor Z es de 7ºC, cuántos microorganismos quedarán luego del tratamiento a 79ºC?¿Cuánto tiempo se requeriría para lograr el mismo grado de letalidad a 65ºC?¿Cuánto tiempo llevaría reducir la concentración a 1ufc/100ml con un tratamiento a 65ºC?

18 Agentes Físicos CALOR RADIACIONES FILTRACIÓN

19 Ambos pueden ser utilizados en procesos de esterilización
Calor Calor húmedo Calor seco Ambos pueden ser utilizados en procesos de esterilización

20 Calor húmedo PROCESOS Esterilización:
Vapor saturado a presiones mayores que la atmosférica Tindalización (fraccionada por vapor) Pasteurización UHT MECANISMOS DE ACCIÓN Desnaturalización de proteínas Destrucción de ácidos nucleicos

21 Pasteurización LHT (low temperature holding) 30 minutos a 62.8ºC
HTST (high temperature short time) 15 segundos a 71.6ºC Solo destruye patógenos (Coxiella burnetti, Mycobacterium tuberculosis, etc.) y reduce flora de deterioro NO ES UN PROCESO DE ESTERILIZACIÓN Usos: leche, lácteos, jugos de fruta Louis Pasteur

22 UHT (Ultra high temperature)
140ºC-150ºC durante pocos segundos Proceso continuo Necesita envasado aséptico Si es un proceso de esterilización

23 Tindalización 100 ºC 30 min, 3 días sucesivos
Proceso discontinuo con períodos de incubación intercalados Usos: esterilización de productos de baja resistencia térmica, cuando no existe otra opción John Tyndall

24 Vapor saturado a presiones mayores que la atmosférica
Condiciones: Vapor saturado a temperaturas mayores de 100ºC (PRECAUCIÓN: eliminación total del aire) Equipo: Autoclave Alcance: Se puede conseguir esterilización Usos: Esterilización de materiales y productos termoestables ( salvo productos oleosos y polvos). Descontaminación de desechos biológicos.

25 Autoclave

26 Tamaño del inóculo: 104 esporas
Autoclave Condiciones : 121ºC durante 15 minutos, con cargas iniciales bajas 121ºC durante 30 minutos, con cargas iniciales altas Indicadores: Físicos: Temperatura y/o presión Químicos Indicador biológico: Geobacillus stearotermophilus (D 121ºC=1.5 minutos) Tamaño del inóculo: 104 esporas

27 Perfil de temperatura de un proceso de esterilización por calor húmedo
Temperatura ºC 100 110 120 15 Tiempo (min.) Etapa de calentamiento Etapa de mantenimiento Etapa de enfriamiento 1 2 3

28 Calor Seco Mecanismo de acción: Procesos de oxidación
Controles de proceso de esterilización Indicadores físicos y químicos Indicador biológico esporas de Bacillus subtilis var. niger (D 160ºC = 0.3 a 1.8 min, Z=20ºC, tamaño del inóculo: 105 esporas)

29 Calor Seco Aire caliente: Equipo:Hornos eléctricos
Alcance: Se consigue esterilización (170ºC, 60 minutos o 160ºC, 120 minutos) Usos: a) Esterilización de: Materiales resistentes al calor Sustancias no miscibles en agua (inyectables oleosos, siliconas, vaselina líquida) Polvos b) Despirogenizacion (250ºC 45 minutos o 180ºC 4hs, o min)

30 Incineración: Flameado : Destrucción de material contaminado
Desinfección

31 Resistencia a calor RESISTENCIA Priones Endosporas bacterianas +
Mycobacteria Virus sin envoltura lipídica Hongos Bacterias Virus con envoltura lipídica + _

32 Esterilización por filtración
La esterilización por filtración se logra por el paso de un líquido o un gas a través de un material capaz de retener los microorganismos presentes. La esterilización por filtración se emplea para materiales sensibles al calor, tales como ciertos medios de cultivo, azúcares, soluciones de antibióticos y otros medicamentos, etc.

33 Filtros de profundidad:
Estos filtros están elaborados por un material fibroso (papel, asbesto o fibra de vidrio) dispuesto al azar, de manera que dentro de la estructura del filtro se crean vías tortuosas donde pueden quedar retenidos la mayoría de los contaminantes presentes. Filtros de superficie: Son filtros elaborados generalmente de acetato de celulosa o nitrato de celulosa y contienen poros de tamaño uniforme. Este tipo de filtro tiene como ventaja que, al conocer exactamente el tamaño de poro que presentan, se pueden seleccionar filtros capaces de retener la totalidad de los microorganismos presentes en una solución. Sin embargo, se saturan rápidamente y la velocidad de filtración a través de ellos es lenta. La mayor parte de los filtros de membrana se pueden esterilizar en autoclave y luego se manipulan asépticamente al ensamblar el equipo.

34 FILTRACIÓN DE AIRE Filtros HEPA (High Efficiency Particulate Air)
Remoción de hasta el 99.97% de partículas mayores de 0.3 micrones de diámetro Se usan en cabinas o habitaciones de flujo laminar CONTROL Retención Mínima de un 99.97% de partículas generadas mediante ensayo DOP(di-octil-nftalato) en caliente con un diámetro de 0.3 micrones. SE USAN PARA Lograr ambientes con número de partículas controlado: FLUJOS LAMINARES AREAS DE TRABAJO

35 Cabinas de Flujo Laminar Vertical
Salida de aire Protege la muestra, el operador y el medio ambiente Entrada de aire

36 Esterilización por radiaciones
Baja energía Actividad antimicrobiana Alta energía Dos tipos: Radiaciones ionizantes Radiaciones no ionizantes

37 Radiaciones Ionizantes
Características: Alta energía, baja longitud de onda Gran poder de penetración Ionizan átomos y moléculas No requieren altas temperaturas Tipos: Rayos gamma (60Co o 137Cs) Rayos catódicos (electrones acelerados) Partículas beta

38 Mecanismos de acción: Resistencia: Formación de radicales libres
Daño al ADN, ARN Resistencia: Priones Deinococcus radiodurans Enterococcus faecium Esporas bacterianas Virus Hongos Bacterias (en gral) D (kGy) m.o. Bacillus pumilus Staphylococcus spp.

39 Desventajas: Equipo especial, personal entrenado No todos los materiales resisten el tratamiento Reacciones no deseadas en alimentos

40 Radiaciones no Ionizantes
Características: Baja energía, sin poder ionizante Sin poder penetrante Máxima eficiencia biocida a 260nm Mecanismos de acción: Sitio blanco ADN Formación de dímeros de timina Usos: Desinfección de superficies Desinfección de aire y agua NO SE UTILIZAN PARA ESTERILIZAR SINO PARA:

41 ESTERILIZACIÓN POR RADIACION UV
Luz ultravioleta La radiación ultravioleta producida artificialmente en el espectro de 250 nm ha sido utilizada por su actividad germicida esterilizante por más de 30 años. La acción de los rayos ultravioleta se debe a la producción de ozono que logra la asepsia, ya que este gas conserva su acción inhibidora hasta una dilución de 1 x Los aminoácidos aromáticos de las proteínas y las bases puricas y primidinicas, en particular la timina del DNA, son los principales compuesto blancos afectados por la acción bactericida de la acción ultravioleta. Evitando la replicación de las tiras del DNA o causando recombinaciones que terminan en mutaciones mortales. Dímeros de timina

42 Procesos de esterilización
Usos Condiciones Agente Material filtrable 0.22 micras de poro Filtración Material termosensible Resistente al tratamiento 25KGy 45KGy Radiaciones ionizantes Material termoestable No penetrable por vapor 160ºC 2 horas 180ºC 1 hora Calor seco Penetrable por vapor 121ºC 15 min. (o equivalente) Calor húmedo

43 Control de Esterilización
Controles del proceso Indicadores: Físicos Químicos Biológicos Post-proceso: TEST DE ESTERILIDAD !!!

44 Indicador biológico Microorganismo resistente
Controles del proceso Indicador físico Ej: Temperatura, presión Indicador químico Cambio de color Indicador biológico Microorganismo resistente

45 Agentes químicos de esterilización y control del crecimiento
Antisépticos Alcoholes Iodo Órgano-Mercuriales Colorantes Desinfectantes y/o Esterilizantes Cloro y Compuestos clorados Aldehídos Oxido de Etileno Compuestos Fenólicos

46 Lesionan la membrana celular de los microorganismos y desnaturalizan proteínas. Desorganizan la estructura fosfolipídica de la membrana. No destruyen esporas y tienen una acción germicida lenta. Los alcoholes de cadena corta tienen un efecto nocivo mayor que los de cadena larga. Se utilizan en concentraciones del 50 al 70%. Los más utilizados son el etanol e isopropílico. Es un agente oxidante que modifica grupos funcionales de proteínas y ácidos nucleicos. Inactiva proteínas y enzimas por oxidación de los grupos -SH a S-S, pudiendo atacar también grupos amino, indoles, etc. Se utiliza como desinfectante de la piel (tintura de iodo: yodo molecular 2% y yoduro de sodio 2% en alcohol), aunque es irritante. Es efectivo contra esporas en una concentración de 1600 ppm de iodo libre Alcoholes Iodo

47 Peróxido de Hidrógeno Órgano-Mercuriales
Es un antiséptico débil, con capacidad oxidante y formadora de radicales libres. Actualmente, el peróxido de hidrógeno gaseoso se está utilizando como desinfectante de superficies o decontaminante de gabinetes biológicos debido a que no posee las propiedades tóxicas y cancerigenas del óxido de etileno y formaldehído. Peróxido de Hidrógeno Órgano-Mercuriales Estos tipos de compuestos se combinan con los grupos -SH de las proteínas, inactivando enzimas. Dentro de los mercuriales orgánicos se encuentran el metafen y el mertiolate.

48 Colorantes Los derivados del trifenilmetano (violeta de genciana, verde de malaquita y verde brillante) bloquean la conversión del ácido UDP-acetilmurámico en UDP- acetilmuramil-péptido. R = HSO4- Verde Brillante R = Cl- Verde de Malaquita Violeta de Genciana

49 Cloro y sus derivados El cloro, los hipocloritos y las cloraminas son desinfectantes que actúan sobre proteínas y ácidos nucleicos de los microorganismos. Oxidan grupos -SH, y atacan grupos aminos, indoles y al hidroxifenol de la tirosina. El producto clorado más utilizado en desinfección es el hipoclorito de sodio (agua lavandina), que es activo sobre todas las bacterias, incluyendo esporas, y además es efectivo en un amplio rango de temperaturas. La actividad bactericida del hipoclorito de sodio se debe al ácido hipocloroso (HClO) y al Cl2 que se forman cuando el hipoclorito es diluido en agua. El hipoclorito de sodio se comercializa en soluciones concentradas ( g/l de Cloro activo) y Generalmente, se utilizan soluciones con una concentración del % de Cloro activo. Su actividad está influida por la presencia de materia orgánica

50 Aldehídos Son agentes alquilantes que actúan sobre proteínas, lo que provoca modificación irreversible de enzimas e inhibición de la actividad enzimática. Se utilizan como desinfectantes y esterilizantes. Destruyen esporas. El glutaraldehído es el único esterilizante efectivo en frío. El formaldehído como gas se utiliza para descontaminar edificios, ambientes, etc. El formaldehído gaseoso se obtiene por calentamiento del paraformaldehído tiene la desventaja de ser muy irritante y perder actividad en ambientes refrigerados. Glutaraldehido Paraformaldehido Formaldehido

51 Es un agente alquilante que se une a compuestos con hidrógenos lábiles como los que tienen grupos carboxilos, amino, sulfhidrilos, hidroxilos, etc. Es utilizado en la esterilización gaseosa, generalmente en la industria farmacéutica. Sirve para esterilizar material termosensibles como el descartable y plástico, equipos electrónicos, bombas cardiorrespiratorias, etc. Es muy peligroso Oxido de Etileno

52 Compuestos Fenólicos Coeficiente del fenol
Son desinfectantes que provocan lesiones en la membrana citoplasmática porque desordenan la disposición de las proteínas y fosfolípidos. El fenol no es usado a menudo como desinfectante por su olor desagradable, por ser muy irritante y por el resido que queda luego de tratar las superficies. Los derivados del fenol más utilizados son el hexaclorofeno (compuesto difenílico) y los cresoles (alquil fenoles). Estos son muy efectivos a bajas concentraciones contra formas vegetativas de bacterias. No son efectivos contra esporas. Coeficiente del fenol

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54 BIOSEGURIDAD

55 Bioseguridad Contención primaria: protección del personal y del medio ambiente inmediato del laboratorio de la exposición a agentes infecciosos. Contención secundaria: Protección del medio ambiente externo al laboratorio de la exposición a materiales infecciosos Equipos de Seguridad (Barreras Primarias). Los equipos de seguridad incluyen gabinetes de seguridad biológica (BSCs), recipientes cerrados, y otros controles de ingeniería destinados a eliminar o minimizar las exposiciones a materiales biológicos peligrosos. Diseño y Construcción de Instalaciones (Barreras Secundarias) Riesgo Biológico: Es la probabilidad de sufrir cualquier tipo de infección, alergia, o toxicidad por una exposición no controlada a agentes biológicos.

56 Niveles de Bioseguridad

57 Agentes de Riesgo Bioseguridad
Se entiende por agente de riesgo biológico cualquier microorganismo -incluyendo de los genéticamente modificados- cultivo celular, animal o planta o producto de estos, capaz de producir cualquier tipo de infección, alergia o toxicidad en humanos, animales u otros seres vivos.

58 Agentes de Riesgo - Grupo I
Bioseguridad Agentes de Riesgo - Grupo I Sin riesgo o bajo riesgo individual y comunitario. Agentes bien identificados que se sabe que no producen enfermedad en humanos sanos y existe un potencial mínimo de peligro para el personal del laboratorio y el ambiente. Bacillus subtillis Naegleria gruberi virus de la hepatitis canina infecciosa

59 Agentes de Riesgo - Grupo II
Bioseguridad Agentes de Riesgo - Grupo II Riesgo individual moderado y bajo riesgo comunitario. Agentes asociados con enfermedades en humanos, especialmente por ingestión o exposición percutánea o mucosa. Patógenos que pueden producir enfermedad en humanos animales pero es poco probable que sea un problema para los trabajadores del laboratorio, la comunidad, los animales o el ambiente. La exposición en el laboratorio puede producir una enfermedad seria pero existe tratamiento efectivo y las medidas preventivas están disponibles, el riesgo de dispersión de la enfermedad es limitado. Salmonella spp. Virus de la Hepatitis B Toxoplasma spp. Bacillus anthracis Bordetella pertussis

60 Agentes de Riesgo - Grupo III
Bioseguridad Agentes de Riesgo - Grupo III Alto riesgo individual, bajo riesgo comunitario. Trabajo con animales infectados con agentes exóticos que tienen riesgo de transmisión por aerosoles y pueden causar una enfermedad seria o potencialmente letal. Patógenos que usualmente causan serias enfermedades en animales y humanos pero que comúnmente no se propagan de un individuo infectado a otro. Las medidas preventivas y de tratamiento efectivo están disponibles. Brucella bortus Coxiella burnetii Mycobacterium

61 Agentes de Riesgo - Grupo IV
Bioseguridad Agentes de Riesgo - Grupo IV Alto riesgo individual y comunitario. Trabajo con agentes peligrosos que tienen alto riesgo de amenazar la vida, transmitirse por vía aérea o que se desconoce su riesgo de transmisión. Patógenos que usualmente causas serian enfermedades en los animales o los humanos y que pueden transmitirse de un individuo de forma directa o indirecta. Usualmente no están disponibles ni medidas preventivas ni tratamiento efectivo. Virus de Marburg Ebola Virus Junín

62 Gabinetes de seguridad biológica Clase I (Campana)
Bioseguridad Gabinetes de seguridad biológica Clase I (Campana) C. Filtro de Escape HEPA B. Ventana A. Apertura frontal D. Pleno de Escape

63 Gabinetes de seguridad biológica Clase II (Flujo Laminar)
Bioseguridad Gabinetes de seguridad biológica Clase II (Flujo Laminar) A. Apertura Frontal; B. Ventana; C. Filtro de Escape HEPA; E. Pleno de Escape de Presión Negativa; F. Ventilador; G. Filtro HEPA adicional para enviar aire. A. Apertura Frontal; B. Ventana; C. Filtro de escape HEPA; D. Pleno posterior; E. Filtro HEPA de Suministro; F. Ventilador

64 Gabinetes de seguridad biológica Clase III (Flujo Laminar)
Bioseguridad Gabinetes de seguridad biológica Clase III (Flujo Laminar) A. Inserciones para guantes con aros circulares para instalarles guantes del largo del brazo al gabinete;B. Ventana, C. Filtro de Escape HEPA; D. Filtro HEPA de Suministro; E. Caja para Autoclave de Doble Extremo.

65 Transporte de material riesgoso
Bioseguridad Transporte de material riesgoso