Secuenciación y análisis bioinformático de secuencias

Presentación del tema: "Secuenciación y análisis bioinformático de secuencias"— Transcripción de la presentación:

1 Secuenciación y análisis bioinformático de secuencias
Tema 6: Secuenciación y análisis bioinformático de secuencias

2 Puntos a tratar en este Tema :
Métodos de secuenciación del DNA Secuenciación ordenada (clon a clon) STS y ETS Secuenciación aleatoria (Shotgun) Mapas de expresión Bancos de datos Análisis bioinfomático Paquetes de programas

3 Mapas físicos y genéticos
Xg Proteína grupo sanguíneo Ictiosis (un efermedad de la piel) Albinismo ocular Angioqueratoma (crecto celular) Centrómero Fosfoglicerato-quinasa Alfa-galactosidasa Xm Deutan (ceguera color rojo-verde) G6PD Protano (ceguera color rojo-verde) Hemofilía A Mapas genéticos (de ligamiento o recombinación): basados en distancias o frecuencias de recombinación Mapa de ligamiento parcial del cromosoma X de la especie humana

4 Mapa genético del Cromosoma 1
Homo sapiens.

5 Mapas físicos y genéticos
Mapas físicos: la distancia entre marcadores es una distancia física real, basada en bp, Posición citológica en los cromosomas, o fragmentos de cromosomas.

6 Secuenciación automatizada del DNA
Secuenciación basada en la terminación de cadena

7 Vector de clonación Vector plasmídico Vector bacteriófago M13 Fagémido

8 Interpretación de un cromatograma con Chroma

9 Alternativas de secuenciación
Limitaciones de la aproximación clásica 1/ cada experimento Secuenciación por capilaridad 96 canales, 96 secuencias en paralelo < 2 horas/run -> 1000 secuencias/día Pirosecuenciación Adición nucleótidos libera pirofosfato Con enzima sulfurilasa produce flash luminiscente DNA chips 8-meros combinaciones. 256 bases legibles 10-meros combinaciones, 1kb 20-meros 1012 combinaciones, 1MB

10 Alternativas de secuenciación
DNA chips (1 millón oligonucleótidos por cm2) 8-meros combinaciones. 256 bases legibles (raíz cuadrada de las posibles combinaciones) 10-meros combinaciones, 1kb 20-meros 1012 combinaciones, 1MB

11 Proyecto Genoma humano
Ensamblaje de secuencias de DNA contiguas Estrategia del perdigonazo (shotgun) Gran éxito en microorganismos (Haemophilus influenzae) Aproximación Clon a clon (Consorcio público) Aproximación del perdigonazo dirigida (Celera Genomics) Francis S. Collins Proyecto Genoma humano Consorcio público J. Craig Venter PE Celera Genomics

12 Arquitectura del genoma de Haemophilus influenzae

13 Microorganismos secuenciados

14 Aproximación consorcio público: clon a clon (jerárquica)

15 Aproximación consorcio público: clon a clon (jerárquica)

16 Mapeo y Anclaje de STSs STS (Sequence tagged sites):
Secuencia conocida (permite ensayo con PCR) Único Fuentes de STS ESTs (Expressed sequence tags) SSLPs (single sequence length polymorphisms) Random genomic sequences

17 Mapa de STSs

18 Integración de mapas mediante el anclaje de STSs
Contigs Mapa de clones Mapa de STSs Recombinación RH

19 Estrategias de secuenciación del genoma:
Clon a clon vs. Perdigonazo (shotgun)

20 Microorganismos secuenciados
Nuestra visión del árbol de la vida debe ser modificada Familias génicas forman un léxico de biología molecular 50% genes son URFs (unidentified reading frames) Mínimo número de genes para sostener el tipo moderno de célula es 256 El ancestro común de Gram-positivas y negativas tenía probablemente más de 1000 genes Gene shuffling ORFs faltantes de genes existentes

21 Cada genoma completo suministra una cornucopia de información biológica:
Conocimiento del número total de genes Principios sobre la organización básica del organismo (clases funcionales,...) Conocer funciones básicas de los genes conservados en distintas especies (léxico biología molecular) Miramos el bosque, no el árbol

22 Organismos eucariotas secuenciados
Caenorhabditis elegans (gusano nemátodo) Saccharamyces cerevisiae (levadura del pan) Drosophila melanogaster (mosca de la fruta) Arabidopsis thaliana (mala hierba de los prados)

23

24 # pb Organismo # genes 3000 Mb H. sapiens 120 Mb A. thaliana
D. melanogaster 97 Mb C. elegans 12 Mb S. cerevisiae # pb Organismo ~ ~25.000 ~13.600 ~19.000 ~6.000 # genes 3000 genes compartidos entre levadura, drosophila y nematodos (maquinaria básica eucariota) 200 familias en común en fly y nematodo: kit básico para el desarrollo de un animal. 289 genes nefermedades en humanos 177 (61%) en Drosophila. Drosophila 22% no conocidos.

25 Bioinformática Lista de bases de datos de biología molecular en NAR
/vol28/issue1/

26 Bases de datos Primarias Compuestas Secundarias

27 Bases primarias y compuestas de DNA y Proteínas
European Bioinformatics Institute (EBI-UK) Home Page SRSWWW at EMBnet/CNB The National Center for Biotechnology Information (GenBank) NCBI als EEUU:    Entrez DNA Data Bank of Japan (DDBJ) Nucleic Acid Database Genome Sequence Database (GSDB) Genome Database (GDB) SwissProt Protein Data Bank (at EBI) Protein Data Bank (USA) Protein  Information Resource (PIR at Europe) PRF HOME PAGE

28 SRS

29 Entrez

30 Bases secundarias REBASE Codon Usage Database Motius
  SCOP  Clasificació estructural de proteïnes (Univ. de Cambridge)   Prosite   Diccionari de motius (Suissa)   Motif     Cerques de motius proteics al Japó Estructura NRL Protein Structure Database Swiss-Model

31 Bases genòmiques THE INSTITUTE FOR GENOMIC RESEARCH
The Sanger Centre : Projects Microorganismes TIGR Microbial Database MAGPIE GENOME SEQUENCING PROJECT LIST MBCR home page Pseudomonas Genome Project: Obtaining Sequences Streptococcus pyogenes Genomes eucariotes Human Genome Mapping Project Saccharomyces Genome Database Drosophila Anopheles Caenorhabditis elegans

32 Eines i software de biologia molecular a la xarxa
Software de biologia molecular: The Biocatalog Molecular Biology Shortcuts Biotools

33 Los ORFs mayores, el 2 y 5, son potenciales genes candidatos
Los 6 marcos de lectura posibles obtenidos a partir de una secuencia de 9 kb de un hongo Los ORFs mayores, el 2 y 5, son potenciales genes candidatos

34 Protocolo para localización de genes a partir de la inspección de la secuencia
Traducción conceptual de la secuencia Detección ORFs Sesgo de codones Límites exón-intrón Secuencias de control río arriba Búsqueda de homologías

35 Ejercicio Observa el patrón de bandas fingerprint de una pareja y sus 5 hijos. Contesta a las siguientes cuestiones: ¿Qué marcadores se heredan juntos? ¿Qué marcadores parece ser alelos de un mismo locus? ¿Qué marcadores segregan independientemente? ¿Qué marcadores parecen estar ligados en trans? ¿Qué marcadores pueden estar ligados a la enfermedad P?

36 Ejercicio Cinco clones YAC de DNA humano se probaron para STSs.
a. Dibuja el mapa físico de los STSs ordenados b. Alinea los YACs en un contig

37 Ejercicio Este es el pedigrí de una familia con fibrosis quística (en negro). El hijo mayor se ha casado con un primo segundo. Para saber si es portador ha efectuado un test molecular con tres sondas de RFLPs que se sabe están ligadas al gen de la FQ. ¿Es este hombre homocigoto normal o portador? ¿Son sus tres hermanos normales portador o normales? ¿De qué padre heredaron el alelo cada portador?