Iniciación de la replicación en eucariotas: iniciadores y replicadores.

Presentación del tema: "Iniciación de la replicación en eucariotas: iniciadores y replicadores."— Transcripción de la presentación:

1 Iniciación de la replicación en eucariotas: iniciadores y replicadores

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15 Orígenes de replicación en eucariotas inferiores Levaduras Orígenes definidos Coincidencia genética y bioquímica (funcional) No todos los ARS funcionan como Orígenes en cada ciclo de replicación En diferentes ciclos no son siempre los mismos ARS que funcionan como orígenes En cada ciclo existen orígenes “tempranos” y “tardíos”

16 ¿cuál es la molécula iniciadora?

17 ATP-dependent recognition of eukaryotic origins of DNA replication by a multiprotein complex Stephen P. Bell & Bruce Stillman Cold Spring Harbor Laboratory Nature, 357 (1992), 128

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21 “what is true for E. coli is true for an elephant”

22 Molecular and Cellular Biology, October 1999, p. 6699-6709, Vol. 19, No. 10 Clustered Adenine/Thymine Stretches Are Essential for Function of a Fission Yeast Replication Origin Yukiko Okono, Hiroyasu Satoh, 2 Mariko Sekiguchi, and Hisao Masukata 3,** Department of Biology, Graduate School of Science, Osaka University, Toyonaka, 1 and Precursory Research for Embryonic Science and Technology System, Japan Science and Technology Corporation, 3 Osaka 560-0043, and Department of Molecular Biology, School of Science, Nagoya University, Chikusa-ku, Nagoya 464-8602, 2 Japan

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26 Análisis de secuencia del genoma de S. pombe

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29 ¿Qué pasa en eucariotas superiores, eh?

30 Breve relato acerca de como sapos y moscas precipitan el derrumbe...

31 Experimentos de Harland and Laskey

32 Cualquier pedazo de DNA humano de un tamaño suficiente confiere a un plásmido la habilidad para ser replicado. En estos casos la replicación comienza en sitios localizados al azar, no sólo en la porción de DNA humano sino en la secuencia del plásmido bacteriano. Estos resultados sugieren que no se requeriría una secuencia consenso para iniciar la replicación en células de mamíferos.

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35 Sin embargo...

36 Renace una esperanza!!!

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38 Estructura del gen de la beta globina Clonado de diferentes regiones del gen beta globina en un vector de expresión que contiene promotores para la RNA polimerasas de fagos T7 y T3

39 Preparación de sondas complementarias a las cadenas (+) o (-) de diferentes regiones del gen de beta globina. Se obtienen a partir de la transcripción in vitro de los clones con diferentes regiones del gen de beta globina

40 Células permeabilizadas+BrdU+emetina Extracción DNA Fragmentación (500 pb) Gradiente de CsCl DNA híbrido Separación por anti-BrdU Blotting en filtros Hibridización con sondas (+) y (-)

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42 Células de pacientes con hemoglobina Lepore

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44 Células sincronizadas Ingreso en fase S Nonidet (permeables) BrdU+ATPgamma32P (pulso) Extracción DNA Electroforesis gel agarosa Fragmentos 50 – 250 pb Inmunoppción anti-BrdU Blotting en filtros Hibridización con sondas (+) y (-)

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47 Dos tipos de orígenes en mamíferos Regiones que actúan como zonas de iniciación donde la replicación comienza en uno o varios sitios sobre muchos potenciales dentro de una región más grande (locus DHFR, locus rDNA) Orígenes localizados en regiones pequeñas donde la replicación comienza en cada ciclo celular (B2 lamina, beta globina)

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49 En ambos casos secuencias distales son necesarias para una eficiente iniciación de la replicación

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52 DHFR BE2121 ori  ori  17kb23kb DHFR locus A favor de un origen localizado ori  : 500 pb con 80% de iniciaciones Inserción ectópica y al azar de ori  funciona como origen

53 En contra de un origen localizado Hay iniciación en al menos 30 sitios dentro de las 40 kb Deleción de ori  no afecta la iniciación en el DHFR locus Deleción de las 40 kb no afecta la iniciación espacial ni temporal DHFR BE2121 ori  ori  17kb23kb

54 Conclusión

55 Orígenes de replicación localizados Gen beta globina Gen B2 lamina Región pequeña (500 pb) Inserción ectópica confiere capacidad de replicar

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58 Preguntas con respuestas pendientes en el área de la replicación ¿Existen orígenes de replicación definidos en eucariotas?

59 ¿Es la misma proteína iniciadora ORC?

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65 Conserved Initiator Proteins in Eukaryotes Kimberley A. Gavin, Masumi Hidaka, Bruce Stillman Science, Vol 270, Issue 5242, 1667-1671 8 December 1995 The origin recognition complex (ORC), a multisubunit protein identified in Saccharomyces cerevisiae, binds to chromosomal replicators and is required for the initiation of cellular DNA replication. Complementary DNAs (cDNAs) encoding proteins related to the two largest subunits of ORC were cloned from various eukaryotes. The cDNAs encoding proteins related to S. cerevisiae Orc1p were cloned from the budding yeast Kluyveromyces lactis, the fission yeast Schizosaccharomyces pombe,and human cells. These proteins show similarity to regulators of the S and M phases of the cell cycle. Genetic analysis of orc1 + from S. pombe reveals that it is essential for cell viability. The cDNAs encoding proteins related to S. cerevisiae Orc2p were cloned from Arabidopsis thaliana, Caenorhabditis elegans, and human cells. The human ORC-related proteins interact in vivo to form a complex. These studies suggest that ORC subunits are conserved and that the role of ORC is a general feature of eukaryotic DNA replication.

66 Paradoja de la especificidad del replicador (ORC)

67 Mecanismos que determinan la unión específica de ORC... o posibles respuestas a la paradoja Distintos tipos de ORC Concentración de ORC Actividad transcripcional Metilación del DNA y acetilación de histonas Intervención de otras proteínas

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80 Preguntas con respuestas pendientes en el área de la replicación ¿Existen orígenes de replicación definidos en eucariotas? ¿Cómo se logra la especificidad de la proteína iniciadora ORC?