BRAZ, Bárbara CUGLIANDOLO, Fiorella ORQUERA, Daniela.

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1 BRAZ, Bárbara CUGLIANDOLO, Fiorella ORQUERA, Daniela

2 Introducción El inhibidor de apoptosis cIAP2 es un inhibidor directo de caspasas y posee actividad E3 ubiquitina ligasa, la que media la poliubiquitinación y degradación de las proteínas de muerte celular claves smac/Diablo y RIP.

3 También dirige la monoubiquitinación de las caspasas 3 y 7 y del factor proapoptótico DEDD, el cual se trasloca del núcleo al citoplasma como consecuencia. cIAP2 es un oncogén La sobreexpresión de cIAP2 se ha visto relacionada con diferentes tipos de cáncer

4 La expresión de cIAP2 está muy controlada tanto a nivel transcripcional como a nivel traduccional. Incluso en ciertos casos se encuentra mRNA de cIAP2 presente en ausencia total de prteína cIAP2

5 La mayoría de los mRNAs son transcriptos a través de un mecanismo de reclutamiento de la subunidad 40S del ribosoma mediado por cap A ello le sigue un escaneo lineal del mRNA por el ribosoma río abajo hacia el primer AUG que se encuentre en un contexto de iniciación adecuado,

6 Existen tres mecanismos alternativos principales que utilizan los ribosomas para facilitar el acceso a AUGs que se encuentran más lejos del 5’ cap. Primero, la presencia de uno o varios (uno a cuatro) ORFs cortos (uORFS) en la región 5’ UTR Esto inhibe la traducción del mRNA pero permite la activación relativa bajo algunas condiciones Es un mecanismo de reiniciación regulado que permite al ribosma bypasear uORFS para llegar al verdadero codón de iniciación, activando la traducción bajo condiciones de estrés

7 El segundo emcanismo consiste en que el ribosoma bypasea por completo el 5’ cap y se recluta directamente a un sitio interno (IRES: internal ribosome entry site) presente en el mRNA.

8 El tercer mecanismo, “ribosome shunting” fue caracterizado primordialmente en virus. Este mecanismo involucra la traslocación del ribosoma desde un donor de shunt río arriba hasta un aceptor de shunt río abajo, usualmente bypaseando múltiples uORFs y regiones con estructura secundaria estable.

9 Durante el estrés celular, el mecanismo de escaneo dependiente de cap para la iniciación de la traducción es inhibido rápidamente por múltiples mecanismos. La transcripción de proteínas esenciales para la respuesta al estrés celular se inicia gracias a mecanismos alternativos mediados por uORFs y elementos IRES Se ha visto que la transcripción de la proteína HSP70 humana se estimula por el mecanismo de shunting durante un golpe de calor. El mecanismo predominante para la traducción de HSP70 en condiciones normales sigue siendo el escaneo cap-dependiente.

10 Los transcriptos que contienen una región 5’ UTR larga y altamente estructurada que inhibe el escaneo ribosomal suelen traducirse por mecanismos no convencionales de traducción. El transcripto de mRNA para cIAP2 encaja en esta descripción, ya que contiene un 5’ UTR muy largo (2,83 kpb) que contiene 64 uAUGs El objetivo de este trabajo es examinar el 5’ UTR de este transcripto para determinar si tiene la habilidad de mediar alguno de los mecanismos alternativos de iniciación de la traducción.

11 Resultados cIAP2 produce un transcripto de aproximadamente 5.5 kpb, que se expresa en casi 20 tejidos normales humanos distintos. El transcripto contiene un 5’ UTR de 2,78 kpb, que incluye 64 uAUGs antes del verdadero codón de iniciación. Seis de estos AUGs se encuentran en un contexto de iniciación perfecto. Trece de estos AUGs se encuentran en un contexto de iniciación aceptable. Modelando el 5’ UTR por Mfold encontraron que esta secuencia se plegaría en una estructura termodinámicamente estable, que abarca el 90% del 5’UTR y dejaría 62 de los 64 uAUGs inalcanzables. Secuencias repetidas invertidas (IR) Secuencia de poliadenilación Tracto de polipirimidinas D1-D7 dominios de formación de loops

12 Objetivo: Analizar la traducción de cIAP2. Las construcciones fueron transcriptas in vitro para producir transcriptos cappeados y poliadenilados. Cantidades equimolares fueron transcriptas in vivo en extractos no nucleados de células HeLa por 30 minutos.  A pesar de su longitud y complejidad, el 5’ UTR de cIAP2 (p-cIAP2-FL) inició la transcripción con casi 25% de la intensidad observada para el control (p- FL) tanto in vitro como in vivo.

13  La inserción de un loop estable hacia el 5’ de cIAP2 5’ UTR (php- cIAP2-FL) inhibió el escaneo del ribosoma y disminuyó la expresión en un 98%  El reemplazo del m7cap por un ApppG cap análogo que no puede unir eIF4E inhibe mucho la traducción del 5’ UTR tanto en presencia (php-cIAP2-FL AppG cap) como en ausencia (php-cIAP2-FL AppG cap) del loop hacia 5’. Lo mismo ocurre tanto in vitro Como in vivo

14 Objetivo: Analizar la posible actividad IRES del cIAP2 5’UTR Se transfectaron mRNAs dicistrónicos conteniendo la secuencia cIAP2 en células 293T  En comparación con un RNA dicistrónico reportero que contiene el HCV IRES (pRL-HCV-FL) y un control negativo que contiene un HCV IRES invertido (pRL-revH-FL), no se detectó traducción mediada por IRES para la construcción que contiene el 5’ UTR de cIAP2 (pRL- cIAP2-FL)  Las células fueron tratadas con thapsigargina para inducir estrés, sin obtener un resultado que indique actividad IRES en el 5’UTR.

15 Al analizar la potencial estructura secundaria por Mfold, se detectaron estructuras similares a las requeridas por el CaMV Shunt. Éste requiere un uORF en un buen contexto de iniciación para iniciar la traducción. Se encontró alto grado de homología en los 5’ UTR supuestos en especies como el perro, la gallina y la zarigüeya entre otros.

16 El 5’ UTR de cIAP2 media la traducción vía ribosome shunting Mutación selectiva de estructuras de cIAP2 5’UTR que en CaMV son esenciales para un shunting eficiente Transcripción in vitro Traducción IN VITRO extracto de células HeLa Traducción IN VIVO células 293T Reporteros cIAP2 5’ UTR mutantes T7 5’ UTR mutadoFLucPoli A site m7Gm7G 5’ UTR mutadoFLucPoli A mRNA Medición de actividad FLuc

17 Estructura de 5’ UTR de cIAP2 2,48 kB + 62 uAUGs Exón 1 Stem Dom3 Dom4+5 5’

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20 Stem facilita la transferencia desde es sitio donor al sitio aceptor de shunt.  stem se inhibe un 90% la traducción. Deleción + conservadora (GGG por CCC) Inhibe eficiencia de traducción en un 75% Apareamiento de bases estable es esencial para una traducción eficiente

21 Shunting requiere la traducción de un uORF ubicado upstream respecto al stem.  uORF2 (AUG por AUC) inhibe la traducción en un 63% in vitro y 81% in vivo Esperaban reducción mayor por deleción de todo el extremo donor  pero quedan 27 uAUGs y otras estructuras estables del stem. Deleción de los primeros 1230 nt (desde extremo hasta primera porción del stem) reduce un 60% la traducción

22 Scaning vs. Shunting Exón 1 Stem Dom3 Dom4+5 5’ Annealing con primers DNA Tratamiento con RNAsa H (nicks en el 5’UTR dificultan scanning) Traducción de mRNA digerido y no digerido Ambos se traducen A pesar de que el mensajero no es contiguo, se traduce igual

23 Adición de una “C” en uORF1 (cambio en el marco de lectura)  se podria bypasear el uORF2 lo cual podría ↓↓ la traducción Inhibe traducción solo en un 25%  indica que >ria de ribosomas bypasean uORF1 Deleción de Exón1 (que incluye uORF1) se espera que ↑ traducción xque solo esta uORF2 el cual la favorece. Sin embargo, se inhibe un 20%  Exón 1 facilita traducción por un mecanismo no definido.

24 Deleción de la región de 2,48 kB y adición de estructura estable que bloquea los ribosomas en scanning. Traducción disminuye un 90%  región es necesaria para el shunting Se presume que estructura de 2,48 kb es bypaseada por el ribosoma en el shunting

25  Dom3 (alta homología), se inhibe la traducción en un 80% Deleción de Dom 4+5 no afecta la traducción

26 Analizan si la localización del codón de inicio es crítica para el shunting  mueven el codón AUG 18 nt downstream No se modifica la eficiencia de la traducción

27 Estabilidad de los reporteros fue monitoreada con RNA marcado radiactivamente a distintos tiempos. Todos tienen una estabilidad equivalente

28 La traducción mediada por cIAP es modulada por el estrés celular La traducción mediada por IRES de varias proteínas antiapoptóticas es modulada por estrés Tratan de determinar si la eficiencia de la traducción de cIAP2 5´UTR mediada por shunting responde a condiciones de estrés. CONDICIONES DE ESTRES Influencia del estrés en cIAP2

29 CONDICIONES DE ESTRES Ensayo de actividad relativa de Luciferasa 1 hora después Tratamiento con distintos agentes que inducen estrés 6 hs antes de cosechar las células

30 La traducción mediada por cIAP2 5´UTR se ve disminuida en respuesta al tratamiento. La traducción mediada por cIAP2 5´UTR se ve incrementada en respuesta al tratamiento. CONDICIONES DE ESTRES No todos los agentes que inducen estrés estimulan la traducción mediada por cIAP2 5´UTR Tratamiento con las distintas drogas

31 CONDICIONES DE ESTRES La respuesta al estrés no es a nivel transcripcional sino a nivel traduccional Autoradiografía estabilidad de los mensajeros Expresión del mensajero para distintos tratamientos en células 293T

32 CONDICIONES DE ESTRES Deleción de dominios internos y respuesta al estrés Dominio 3: altamente conservado podría atraer proteínas de unión al RNA que modulen la eficiencia del inicio de la traducción mediada por shunting Dominio 4 y 5: no conservados

33 CONDICIONES DE ESTRES El dom 4 y 5 mutado no aumenta ni disminuye la eficiencia de la traducción Entonces… sin etoposide: ↓ la eficiencia de la traducción respecto al W. Type con etoposide: ↑ la eficiencia de la traducción hasta alcanzar los valores de la W. Type sin etoposide El dominio 3 parece jugar un rol importante facilitando el shunting sin etoposide: similar a W Type (no baja como la deleción del dom3) con etoposide: similar a W. Type Dominio 3 Dominio 4 y 5

34 CONDICIONES DE ESTRES Inmunoblot de proteina cIAP2 endógena en células T293 tratadas con cantidades crecientes de drogas que inducen estrés (18 hs) Niveles endógenos de cIAP2 en condiciones de estrés A

35 Cuantificación por densitometria de cIAP2 endógena CONDICIONES DE ESTRES B

36 Estudios previos establecieron que un splicing alternativo inducido por estrés podría remover la estructura secundaria incrementado la traducción, generando un transcripto de menor tamaño (2,7 kb). Para asegurarse de que el splicing alternativo no produce un extremo 5’UTR de menor tamaño capaz de traducir por scanning convencional  Northern mRNA Células con stress inducido por drogas Células no tratadas

37 En todas las líneas celulares se observó el transcripto de mayor tamaño (5,5 a 6 kb). No se observó el transcripto más pequeño. Stress no altera el splicing del transcripto endógeno de cIAP2 Northern revelado con sonda anti-C’terminal de la región codificante de cIAP2 RT-PCR con primers para amplificar el extremo 5’UTR de cIAP2

38 El largo y la complejidad de cIAP2 5´UTR sugiere que se podrían reclutar factores que facilitan o inhiben el shunting durante el estrés Los dominios no conservados 4+5 no son tan importantes para este mecanismo Dentro de la región stem stable, el dominio 3 parece tener una gran importancia para el shunting, ya que su deleción afecta la eficiencia de la traducción La eficiencia del shunting durante el estrés podría ser controlada por factores regulatorios trans activadores CONDICIONES DE ESTRES Conclusiones