Introducción a la espectroscopía vibracional

Presentación del tema: "Introducción a la espectroscopía vibracional"— Transcripción de la presentación:

1 Introducción a la espectroscopía vibracional
.Conceptos básicos Estados vibracionales y energía Modos normales de vibración frecuencia de vibraciones .Técnicas Espectroscopía infrarroja Regiones del IR Grupos funcionales "Huellas digitales" Número de ondas e intensidad Reglas de selección FTIR y sus ventajas Espectroscopía Raman Dispersión inelástica de fotones (Stokes y anti-Stokes) Reglas de selección Ventajas sobre el IR Resonanacia Raman .Aplicaciones a proteínas Análisis de estructura secundaria Cálculos Asignaciones Uso de isótopos Grupos laterales

2 Bibliografía Campbell, I.D. and Dwek, R.A.; Biological Spectroscopy; Benjamin Cummings (1984) Cantor, C.R. and Schimmel, P.R.; Biophysical Chemistry; Vol 2, (1984). Krimm, S and Jagdeesh Bandekar, Vibrational Spectroscopy and Conformation of Peptides, Polypeptides and Proteins; Adv. Prot Chem. 38; (1986), p. 180 Susi, H and Byler, D.M.; Resolution Enhanced Fourier Transform Infrared Spectroscopy of Enzymes; Methods in Enzymology; 130, p 290 Williams, R.W.; Protein Secondary Structure Analysis Using Raman Amide I and Amide III Spectra; Methods in Enzymology; 130, p 311

3 Introducción a la espectroscopía vibracional
Espectro electromagnético Frecuencia (Hz) Longitud de onda Tipo de radiación Tipos de transición m Rayos gamma Nuclear 1 nm - 1 pm Rayos X Electrones internos nm Ultravioleta Electrones externos 4.3x x1014 nm Visible 2.5 µm nm Infrarrojo Vibraciones 1 mm µm Microondas Rotaciones m Radiofrecuencia Inversión de spin

4 Estados vibracionales y energía
Frecuencia de la vibración k = constante de fuerza del enlace F = -kx µ = masa reducida, para un sistema diatómico

5 Modos normales de vibración (3N - 5)
cm-1 IR RAMAN estiramiento (sim) 1340 - + estiramiento (asim) 2349 deformación 667 O C O C O C O C

6 Técnicas: INFRARROJO Reglas de selección:
No todas las vibraciones serán “activas” en IR Sólo aquellas en las que cambie el momento dipolar permanente durante la vibración

7 INFRARROJO

8 INFRARROJO N-H C-H C=O

9 FTIR Espectrometría IR con Transformada de Fourier
Mejor relación señal/ruido ya que la luz no debe pasar por un monocromador. Se miden todas las frecuencias a la vez lo que da mucha mayor rapidez Puede tener una resolución de menos de 0.01 cm-1 Los espectros pasan necesariamente por una computadora lo que facilita el análisis y manejo espectral

10 Modos normales de vibración del grupo amida
(valores para metilacetamida) estiramiento NH (3236 F) amida I (1653 F) amida II (1567 F) amida III (1299 M) C N H O amida IV (627 D) amida V (725 F) amida VI (600 M) amida VII (206 M) estiramiento NC (1096 D) estiramiento CN y CC (881 D) deformación CCN (436 D) deformación CNC (289 D)

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12 Estructura secundaria
ovillo estadístico hélice a transición a  b b antiparalela Susi, H., Timasheff, S and Stevens, L. J Biol Chem (1967) 242,

13 Estructura secundaria
Estructura a Estructura b Goormaghtigh, E; Ruysschaert, J. M. and Raussens, V Biophysical Journal Volume 90 April –2957

14 Porcentajes de hélice y cadena extendida obtenidas por rayos X y FTIR
Proteína % Hélice % Cadena extendida FTIR RX Carboxipeptidasa 40 39 33 30 α-Quimotripsina 12 10 50 49 Concanavalina A 4 2 60 Lisozima 41 45 21 19 Papaína 27 29 32 Ribonucleasa A 22 46

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16 Uso de isótopos 1H2O 2H2O Efecto de la deuteración de la proteína sobre la posición de la banda amida I J. Biol. Chem. (1998) 273:

17 Uso de isótopos BIAP (A) apo BIAP (B) Asignación tentativa 1682 nC=O amida I (hoja b) 1660 nC=O amida I (giro) 1651–1652 1652 nC=O amida I (hélice a) 1633 1586–1577 1586–1571 nC=O COO– Asp o Glu 1547 d N-H amida II 1516–1517 n OH anillo Tyr 1443 1455 d N-2H amida II y 2HOH Asignación tentativa de las diferentes bandas en el espectro FTIR de BIAP y apoBIAP en 2H2O, pH 6.6

18 Uso de isótopos 1 = 27 min 2 = 63 min 3 = 180 min 4 = 21 h
Efecto del tiempo en la deuteración de tripsina en 2H2O a 25º C, pD = 3.1 Eur. J. Biochem. 48, (1974)

19 Isótopos y posición de las bandas
FTIR de monóxido de carbono unido a citocromo c aa3 de T. termophilus. Referencia: Pinakoulaki, E.; Soulimane, T. and Varotsis, C. (2002) J. Biol. Chem. 277:32867.

20 Unión de ligandos

21 Técnicas: Raman Dispersión inelástica de fotones
estados electrónicos virtuales Sir Chandrasekhara Venkata Raman, (சந்திரசேகர வெங்கடராமன்) Tiruchirapalli, Tamil Nadu -7/11/1888  Bangalore, Karnataka - 21/11/1970 Premio Nobel de Física 1930

22 Láser, luz monocromática
muestra Láser, luz monocromática Regla de selección: Para que la vibración sea activa en Raman debe provocar un cambio en la polarizabilidad de la molécula. Monocromador, espectrógrafo Ventajas de Raman con respecto a IR Se mide en el visible o el UV donde los detectores son mucho más sensibles El agua produce una dispersión Raman muy débil La resonancia Raman permite sondear grupos asociados a cromóforos con una sensibilidad veces mayor

23 N N

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26 Resonancia Raman Resonancia Raman Raman
estado electrónico excitado estado energético virtual Resonancia Raman Raman estado electrónico basal La resonancia Raman es más intensa que la dispersión Raman, pero necesita que exista un cromóforo y sólo se intensifican las bandas debidas al cromóforo

27 l = nm Das, T. K., S. Mazumdar and S. Mitra (1998). Eur J Biochem 254(3):

28 [hemo] = 0.34 mM [SO42-] = 400 mM SO42-
Spiro, T. C. and Strekas, T. G. (1973) JACS 96: 338

29 Uso de isótopos Unión de óxido nítrico a superóxido reductasa de Pyrococcus furiosus l = 476 nm

30 Espectro IR de BSA sólida (azul) y espectro Raman de BSA en solución en amortiguador de fosfato (rojo).

31 Infrarrojo y Raman El fenómeno de absorción es más intenso por lo que se requieren muestras menores El equipamiento es más sencillo y de uso más flexible No presenta interferencias con otros fenómenos físicos (p. ej. fluorescencia) Se mide en el visible o UV donde los detectores son mucho más sensibles El agua produce una dispersión Raman muy débil El Raman resonante permite sondear grupos asociados a cromóforos con una sensibilidad varios órdenes de magnitud mayor

32 Introducción a la espectroscopía vibracional
.Conceptos básicos Estados vibracionales y energía Modos normales de vibración frecuencia de vibraciones .Técnicas Espectroscopía infrarroja Regiones del IR Grupos funcionales "Huellas digitales" Número de ondas e intensidad Reglas de selección FTIR y sus ventajas Espectroscopía Raman Dispersión inelástica de fotones (Stokes y anti-Stokes) Reglas de selección Ventajas sobre el IR Resonanacia Raman .Aplicaciones a proteínas Análisis de estructura secundaria Cálculos Asignaciones Uso de isótopos Grupos laterales