Infección de cultivos celulares por el virus de la hepatitis C

Presentación del tema: "Infección de cultivos celulares por el virus de la hepatitis C"— Transcripción de la presentación:

1 Infección de cultivos celulares por el virus de la hepatitis C
1 Infección de cultivos celulares por el virus de la hepatitis C Identificación de nuevas dianas y compuestos antivirales Curso de Hepatología Básica-AEEH Pablo Gastaminza, Madrid,

2 Contenidos: Introducción: Virología de VHC Estructura genómica
2 Contenidos: Introducción: Virología de VHC Estructura genómica Ciclo de replicación Modelo de Infección Basado en JFH-1: Principios y componentes Aplicaciones Aspectos fundamentales Identificación de nuevas dianas Rastreo de compuestos antivirales Conclusiones y Perspectivas

3 Cultivos Celulares Susceptibles
Modelos Experimentales en Virología Hospedador Natural Cultivos Celulares Susceptibles Cultivo Celular Hospedador Natural Modelos in vivo Modelos animales pequeños Modelos en primates Epidemiología Genética viral Patogénesis Immunología Patogénesis Immunología Vacunas Antivirales (seguridad, eficacia) Genética reversa Factores celulares Antivirales

4 Hepatocitos primarios (alta variabilidad y acceso limitado)
Modelos Experimentales en VHC Hospedador Natural Cultivo Celular Modelos in vivo Hospedador Natural Ratones inmunoKO quiméricos Hepatocitos primarios (alta variabilidad y acceso limitado) Chimpancés Epidemiología Genética viral Patogénesis Immunología Patogénesis Immunología Vacunas Antivirales (seguridad, eficacia) Genética reversa Factores celulares Antivirales

5 Hepatitis C Virus (Flaviviridae)
5 Hepatitis C Virus (Flaviviridae) Virión Replicasa Ensamblaje

6 Hepatitis C Virus (Flaviviridae)
6 Hepatitis C Virus (Flaviviridae) Virión Replicasa Ensamblaje

7 Ciclo de Infección de VHC
7 Ciclo de Infección de VHC HCVpp Bartosch et al J Exp Med 2003 Hsu et al J Virol 2003 CLDN1 OCDN1

8 Ciclo de Infección de VHC
8 Ciclo de Infección de VHC CLDN1 OCDN1 REPLICONS Lohman et al. Science 1999 Blight et al. Science 2000

9 Replicones para identificar inhibidores de VHC
9 Transfección de ARN subgenómico en células Huh-7 Hours post-transfection DMSO 0.5 1 1.5 2 2.5 5 10 24 48 Relative Luciferase Activity (LOG) Luciferase Activity 5’UTR 3’UTR NS3-NS5B IRES Luc Electroporation into Huh-7 cells 2mAde Luciferase Activity

10 Ciclo de Infección de VHC
1010 Ciclo de Infección de VHC CLDN1 OCDN1 HCV INFECTION CELL CULTURE MODEL (JFH-1) Wakita et al. Nature Med 2005 Lindenbach et al. Science 2005 Zhong et al. PNAS 2005

11 Contenidos: Introducción: Virología de VHC Estructura genómica
1111 Contenidos: Introducción: Virología de VHC Estructura genómica Ciclo de replicación Modelo de Infección Basado en JFH-1: Principios y componentes Aplicaciones Aspectos fundamentales Identificación de nuevas dianas Rastreo de compuestos antivirales Conclusiones y Perspectivas

12 Células Susceptibles (Huh-7 y Derivados)
Obtenidas por cultivo primario de un hepatocarcinoma bien diferenciado de un paciente japonés de 57 años (Nakabayashi et al. Cancer Research 1982) Línea celular capaz de sostener la replicación de replicones de VHC (Lohmann et al 1999; Blight et al. 2000) Subclones de la línea Huh-7 (Huh-7.5) obtenidos por selección de células con mayor capacidad de replicación de replicones de VHC. (Blight et al.2002)

13 Clon molecular infeccioso JFH-1 (2a)
1313 Clon molecular infeccioso JFH-1 (2a) Japonese patient with Fulminant Hepatitis Sequencing of different quasispecies Construction of a consensus molecular clone (JFH-1) Dr. Takaji Wakita

14 Virus infeccioso en cultivo y en modelos animales
Rescate de virus infeccioso a partir de cDNA de JFH-1 Clon Molecular (cDNA) ARN Genómico (desnudo) Transfección Transcripción In vitro Virus infeccioso en cultivo y en modelos animales VIRUS RECOMBINANTE=OMG: LABORATORIO P3 !!!

15 Producción de Virus Infeccioso en Cultivo
1515 Producción de Virus Infeccioso en Cultivo cDNA (plásmido bacteriano) vRNA JFH-1 Transfección Huh-7 Huh-7.5.1 Líneas de hepatoma humano Undiluted Sobrenadante Sin diluir NS5A nucleo 1:100 1:10 La infectividad se expresa como unidades formadoras de foco por mililitro (ffu/ml)

16 Propagación de Virus Infeccioso en Cultivo
1616 Propagación de Virus Infeccioso en Cultivo Days post-infection Infectivity ( log ffu/ml) 1 2 3 4 5 10 15 Supernatant Infectivity JFH-1 RNA Transfection Huh-7 Huh-7.5.1 Huh-7 Huh-7.5.1 Infection Diluted supernatant day 3 day 8

17 Características Básicas de Viriones de VHC
Gastaminza et al. J Virol 2010

18 Estructura 3D de Complejos de Replicación
Romero-Brey I. Plos Pathogens 2012

19 Estudios de Genética Inversa
Clon Molecular (cDNA) Transcripción In vitro ARN Genómico (desnudo) Transfección FENOTIPO Crecimiento del virus Resistencia a fármacos MUTACIÓN Mutaciones en regiones del genoma viral de función desconocida Mutaciones que aparecen como consecuencia de tratamientos farmacológicos.

20 Genética Inversa De La Viroporina P7
Steinmann et al Plos Pathogens 2007

21 Factores Celulares Implicados en la Infección por VHC
Clon Molecular (cDNA) MUTACIÓN FENOTIPO ARN Genómico (desnudo) Transfección Transcripción In vitro Silenciamiento (RNAi) y sobreexpresión de genes celulares Inhibidores de procesos celulares conocidos

22 Factores Celulares Implicados en la Infección por VHC
Dreux M et al. PNAS 2009;106: AUTOFAGIA Gastaminza P. et al.J Virol March; 82(5): 2120–2129. BIOGÉNESIS DE VLDL

23 Realizado en la Unidad de Microscopía Confocal CNB-CSIC
Visualización de la Infección en Tiempo Real Marcador de Infección Marcador Celular de Interés Realizado en la Unidad de Microscopía Confocal CNB-CSIC Metodología en Jones et al. Nat Prot 2010

24 Identificación De Nuevos Compuestos Antivirales
2424 Identificación De Nuevos Compuestos Antivirales Rastreo de colecciones de compuestos Identificar compuestos químicos no tóxicos con actividad frente a VHC: Para utilizarlos como herramientas para estudios básicos. Para identicar moléculas con potencial terapéutico. Gastaminza et al. PNAS 2010

25 Rastreo De Colecciones De Compuestos Con Potencial Antiviral
2525 Gastaminza et al. PNAS 2010

26 Fármacos de uso clínico con actividad Antiviral
Gastaminza et al. PNAS 2010

27 Iniciación de la replicación
Descubrimiento De Nuevos Compuestos Antivirales Screening de compuestos de actividad desconocida PNAS Dic 2007 Compuesto Modo de acción Péptido lineal Viricida (no específico) Chemistry and Biology 2011 Péptido cíclico Entrada viral (específico) J Virol Jun 2011 Moléculas bajo Pm Iniciación de la replicación (específico)

28 Sistema JFH-1 de Infección en Cultivo
Permite medir infectividad de muestras generadas en diferentes condiciones experimentales (antes solo posible en chimpancés) Permite manipular la información genética del virus y analizar las consecuencias de dichos cambios en cualquier aspecto de la infección (genética inversa) Permite el estudio fenotípico de un virus en cultivos celulares sometidos a variaciones experimentales controladas: silenciamiento génico, tratamientos farmacológicos, etc… No permite el estudio sistemático de cualquier aislado clínico de VHC, aunque se han generado virus quiméricos que producen viriones de diversos genotipos. Depende de líneas celulares transformadas con escasa diferenciación hepática. RELEVANCIA???

29 Futuros Desafíos Desarrollo de un sistema de infección con aislados primarios de pacientes: línea(s) celular(es) susceptibles. Desarrollo de un sistema de infección para otros genotipos: clones infecciosos en cultivo celular.

30 Agradecimientos Lidia Mingorance Martina Friesland Claudia Vasallo
3030 Agradecimientos Lidia Mingorance Martina Friesland Claudia Vasallo Gema Calvo Chiara Sorbo

31