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CULTIVO IN VITRO DE VEGETALES EN BIOFABRICAS. Cultivo de tejidos Presupone el cultivo de plantas o partes de plantas () en un medio de cultivo apropiado.

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1 CULTIVO IN VITRO DE VEGETALES EN BIOFABRICAS

2 Cultivo de tejidos Presupone el cultivo de plantas o partes de plantas () en un medio de cultivo apropiado Presupone el cultivo de plantas o partes de plantas (explantos) en un medio de cultivo apropiado El cultivo se desarrolla en condiciones de temperatura, humedad, fotoperíodo e irradiancia controlados. El cultivo se desarrolla en condiciones de temperatura, humedad, fotoperíodo e irradiancia controlados. La manipulación se realiza en cabinas de flujo laminar La manipulación se realiza en cabinas de flujo laminar Esta técnica es importante en la propagación de especies de interés agroforestal y agrícola: micropropagación Esta técnica es importante en la propagación de especies de interés agroforestal y agrícola: micropropagación

3 Producen innumerables productos de importancia en la industria farmacéutica, cosmética y alimentaria, como alcaloides, compuestos o pigmentos. Producen innumerables productos de importancia en la industria farmacéutica, cosmética y alimentaria, como alcaloides, compuestos aromáticos o pigmentos. Los cultivos in vitro permiten obviar los inconvenientes derivados de condiciones geográficas, climáticas y de tiempo de producción. Los cultivos in vitro permiten obviar los inconvenientes derivados de condiciones geográficas, climáticas y de tiempo de producción.

4 Cultivo in vitro

5 Plasticidad Plasticidad Totipotencialidad Totipotencialidad Es la capacidad de una célula vegetal de dar lugar al desarrollo de una planta completa. Las células totipotentes son células somáticas que han retenido su capacidad de dividirse y diferenciarse en una planta madura si se coloca en el medio adecuado. Es la capacidad de una célula vegetal de dar lugar al desarrollo de una planta completa. Las células totipotentes son células somáticas que han retenido su capacidad de dividirse y diferenciarse en una planta madura si se coloca en el medio adecuado.

6 Cultivo de células vegetales Definición Cultivo aséptico in vitro de cualquier parte de una planta en un medio nutritivo. Cultivo aséptico in vitro de cualquier parte de una planta en un medio nutritivo. Tipos de cultivos: Tipos de cultivos: cultivo de células cultivo de células cultivo de tejidos cultivo de tejidos cultivos de órganos cultivos de órganos

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8 Cultivos vegetales Cultivos Cultivos agronómicos Cultivos in vitro Cultivos in vitro 1. Cultivos diferenciados ( raíces, tallos, embriones, raíces y tallos transformados) 2. Cultivos indiferenciados ( callos, suspensiones )

9 Cultivos Cultivos indiferenciados Callos : en medio sólido, crecimiento lento, gran heterogeneidad celular, Callos : en medio sólido, crecimiento lento, gran heterogeneidad celular, Cultivos en suspensión: derivan de los anteriores, en medio líquido de composición adecuada, crecimiento más rápido y homogéneo. Cultivos en suspensión: derivan de los anteriores, en medio líquido de composición adecuada, crecimiento más rápido y homogéneo. Composición del medio de cultivo. Fuente de carbono, minerales, vitaminas, fitohormonas (auxinas, citoquininas) Composición del medio de cultivo. Fuente de carbono, minerales, vitaminas, fitohormonas (auxinas, citoquininas)

10 Callos Tejidos no diferenciados ( a veces diferenciados), en división activa. Tejidos no diferenciados ( a veces diferenciados), en división activa. Frecuentemente se desarrollan a partir de heridas. Frecuentemente se desarrollan a partir de heridas.

11 Medio de cultivo Mezcla de sustancias en los que las células, tejidos y órganos pueden dividirse y crecer. Mezcla de sustancias en los que las células, tejidos y órganos pueden dividirse y crecer. Sustancias inorgánicas: N, P, K, Ca, Mg, Cl, Na Sustancias inorgánicas: N, P, K, Ca, Mg, Cl, Na Cu, Zn, Mn, Fe, Bo, Mo, Co, I Cu, Zn, Mn, Fe, Bo, Mo, Co, I Suplementos orgánicos complejos: leche de coco, extracto de levadura. Suplementos orgánicos complejos: leche de coco, extracto de levadura. Reguladores de crecimiento : hormonas. Reguladores de crecimiento : hormonas. Fuente de carbono: sacarosa Fuente de carbono: sacarosa Con o sin agar: medio semi -sólido o líquido. Con o sin agar: medio semi -sólido o líquido.

12 Reguladores de crecimiento Hormonas/ Fitohormonas: Auxinas: grupo de hormonas vegetales (naturales o sintéticas) que inducen la elongación, o en algunos casos la división celular. Auxinas: grupo de hormonas vegetales (naturales o sintéticas) que inducen la elongación, o en algunos casos la división celular. Frecuentemente inducen raíces adventicias e inhiben la formación de tallos adventicios. Frecuentemente inducen raíces adventicias e inhiben la formación de tallos adventicios. Cytokininas: grupo de hormonas vegetales (naturales o sintéticas) que inducen división celular y frecuentemente tallos adventicios y en muchos casos inhiben la formación de raíces adventicias. Cytokininas: grupo de hormonas vegetales (naturales o sintéticas) que inducen división celular y frecuentemente tallos adventicios y en muchos casos inhiben la formación de raíces adventicias. Reglas generales para la acción hormonal: Reglas generales para la acción hormonal: Auxina : Cytokinina = ~1 Callo Auxina : Cytokinina = ~1 Callo Auxina : Cytokinina < 1 Tallo Auxina : Cytokinina < 1 Tallo Auxina : Cytokinina > 1 Raíces Auxina : Cytokinina > 1 Raíces Son producidos por microorganismos Son producidos por microorganismos

13 Terminología y técnicas 1. Explanto: porción de tejido u órgano que se separa de la planta para iniciar el cultivo. 1. Explanto: porción de tejido u órgano que se separa de la planta para iniciar el cultivo. 2. Esterilización: procedimiento para la eliminación de microorganismos. 2. Esterilización: procedimiento para la eliminación de microorganismos. Autoclave: aparato en el que el medio, material d vidrio, instrumental, etc., es esterilizado por vapor bajo presión (121 o C, 15 psi, min.). Autoclave: aparato en el que el medio, material d vidrio, instrumental, etc., es esterilizado por vapor bajo presión (121 o C, 15 psi, min.). Requerimientos de asepsia: desinfección de superficie del explanto: generalmente usando lavandina comercial diluido para evitar el desarrollo de microorganismos. Requerimientos de asepsia: desinfección de superficie del explanto: generalmente usando lavandina comercial diluido para evitar el desarrollo de microorganismos. Cabina de flujo laminar: área de trabajo, mantenida estéril por el flujo continuo, no turbulento de aire estéril. Cabina de flujo laminar: área de trabajo, mantenida estéril por el flujo continuo, no turbulento de aire estéril.

14 Subcultivo: pasaje de células, tejidos, órganos, etc. Desde un medio de cultivo agotado a otro medio fresco. Subcultivo: pasaje de células, tejidos, órganos, etc. Desde un medio de cultivo agotado a otro medio fresco. Micropropagación: propagación vegetativa in vitro de plantas. Micropropagación: propagación vegetativa in vitro de plantas.

15 Diferenciación: desarrollo de células o tejidos con una función específica y/o regeneración de órganos, estructuras tipo órganos (raíces, tallos) o embriones. Diferenciación: desarrollo de células o tejidos con una función específica y/o regeneración de órganos, estructuras tipo órganos (raíces, tallos) o embriones. Adventicios: desarrollo de órganos (raíces, yemas, tallos, flores, etc.) o embriones (embryo-like structures) desde puntos de origen no usuales, incluyendo callos. Adventicios: desarrollo de órganos (raíces, yemas, tallos, flores, etc.) o embriones (embryo-like structures) desde puntos de origen no usuales, incluyendo callos.

16 Organogénesis (formación de órganos) Formación de tallos, raíces, flores, etc. ¡¡Regeneración de una planta completa!! Explanto Organogénesis Formación de tallos Formación de raíces EnraizamientoTallos Planta completa

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22 Embriogénesis (formación de embriones) Proceso mediante el cual se desarrolla un embrión a partir de una célula huevo fertilizada o asexualmente desde un grupo de células somáticas (embriogénesis somática). Proceso mediante el cual se desarrolla un embrión a partir de una célula huevo fertilizada o asexualmente desde un grupo de células somáticas (embriogénesis somática).

23 Embriogénesis Somática Procedimiento para la regeneración vía embriogénesis somática Procedimiento para la regeneración vía embriogénesis somática 1. Iniciación: callos embriogénicos 1. Iniciación: callos embriogénicos 2. Proliferación: callos embriogénicos, masas proembriogénicas (PEM) 2. Proliferación: callos embriogénicos, masas proembriogénicas (PEM) 3. Desarrollo y maduración de embriones : embriones 3. Desarrollo y maduración de embriones : embriones 4. Germinación de embriones (Regeneración) 4. Germinación de embriones (Regeneración) Estadíos de desarrollo en dicotiledóneas: Estadíos de desarrollo en dicotiledóneas: Masas proembriogénicas Masas proembriogénicas Estadío globular Estadío globular Torpedo Torpedo Embrión somático Embrión somático

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26 Semillas artificiales Semillas sintéticas (artificiales) Semillas sintéticas (artificiales) 1. Producción en masa de semillas genéticamente mejoradas. 1. Producción en masa de semillas genéticamente mejoradas. 2. Procedimientos: 2. Procedimientos: Encapsular en cápsulas de gel, recubrir con una cubierta adecuada, almacenar Encapsular en cápsulas de gel, recubrir con una cubierta adecuada, almacenar 3. Encapsulación de embriones somáticos: protección, nutrición, permeable al agua, biodegradable. 3. Encapsulación de embriones somáticos: protección, nutrición, permeable al agua, biodegradable. Polímeros: gel de alginato, gelatina, agar, goma, etc. Polímeros: gel de alginato, gelatina, agar, goma, etc.

27 Variación Somaclonal Variación fenotípica, genética o epigenética en su origen. Variación fenotípica, genética o epigenética en su origen. Permite describir la variabilidad genética observada en tejidos regenerados a partir de cultivos in vitro Permite describir la variabilidad genética observada en tejidos regenerados a partir de cultivos in vitro Es común cuando se regeneran plantas a partir de callos, o cuando los cultivos se establecen a partir de explantos que no contienen un meristema pre-organizado. Es común cuando se regeneran plantas a partir de callos, o cuando los cultivos se establecen a partir de explantos que no contienen un meristema pre-organizado. En muchos casos, el grado de variación es proporcional a la duración del cultivo in vitro. En muchos casos, el grado de variación es proporcional a la duración del cultivo in vitro. Se aplica para mejora de cultivos Se aplica para mejora de cultivos

28 Aislamiento de protoplastos Protoplasto: célula vegetal sin pared celular Protoplasto: célula vegetal sin pared celular Procedimiento: Procedimiento: (1). Digestión de la pared celular: celulasa, hemicelulasa, pectinasa. Son producidos por microorganismos. (1). Digestión de la pared celular: celulasa, hemicelulasa, pectinasa. Son producidos por microorganismos. (2). Regeneración de la pared celular: usualmente dentro de las 24 hrs. (2). Regeneración de la pared celular: usualmente dentro de las 24 hrs. (3). División celular: la primera división ocurre dentro de las hrs (3). División celular: la primera división ocurre dentro de las hrs (4). Proliferación y diferenciación (4). Proliferación y diferenciación

29 Protoplastos

30 Aislamiento, cultivo y fusión de protoplastos Aplicaciones: Aplicaciones: 1. Remoción de pared para captación de DNA : Microinyección y electroporación 1. Remoción de pared para captación de DNA : Microinyección y electroporación 2. estudios de síntesis de pared celular, transporte de membrana, citoesqueleto. 2. estudios de síntesis de pared celular, transporte de membrana, citoesqueleto. 3. estudio de desarrollo de embriones somáticos. 3. estudio de desarrollo de embriones somáticos. 4. hibridización somática (cybridización) de especies sexualmente compatibles o incompatibles, por fusión de protoplastos se obtiene un nuevo germplasma. 4. hibridización somática (cybridización) de especies sexualmente compatibles o incompatibles, por fusión de protoplastos se obtiene un nuevo germplasma.

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33 Aplicaciones 1. Mantenimiento del background genético deseado: micropropagación. 1. Mantenimiento del background genético deseado: micropropagación. 2. Producción en gran escala de cultivares apropiados: embriogénesis somática 2. Producción en gran escala de cultivares apropiados: embriogénesis somática 3. Síntesis de productos usando técnicas de cultivo continuo. 3. Síntesis de productos usando técnicas de cultivo continuo. 4. Eliminación de virus y otros patógenos. 4. Eliminación de virus y otros patógenos. 5. Regeneración de plantas obtenidas por ingeniería genética. 5. Regeneración de plantas obtenidas por ingeniería genética.

34 Cultivos Cultivos diferenciados Raíces y tallos transformados: obtenidas por transformación genética con la bacteria patógena del suelo sp. Raíces y tallos transformados: obtenidas por transformación genética con la bacteria patógena del suelo Agrobacterium sp. Se pueden usar para la producción de metabolitos derivados de raíces, crecimiento rápido, mayor estabilidad genética, mayor productividad. Se pueden usar para la producción de metabolitos derivados de raíces, crecimiento rápido, mayor estabilidad genética, mayor productividad.

35 Tecnología del ADN recombinante El uso de la biotecnología moderna implica, inicialmente, el conocimiento y aislamiento de secuencias de ADN que corresponden a genes responsables de conferir una característica deseada (fenotipo) El uso de la biotecnología moderna implica, inicialmente, el conocimiento y aislamiento de secuencias de ADN que corresponden a genes responsables de conferir una característica deseada (fenotipo) El aislamiento de los genes de interés es realizado por medio de técnicas de clonado molecular El aislamiento de los genes de interés es realizado por medio de técnicas de clonado molecular

36 molecular Clonado molecular Inducción de la amplificación de una secuencia de ADN en un organismo vivo. Inducción de la amplificación de una secuencia de ADN en un organismo vivo. Vectores de clonado (plásmidos o virus): vectores en los que la secuencia de ADN es introducida usando una DNA ligasa. Cuando es necesario el fragmento de ADN de interés puede ser liberado del vector por medio de enzimas de restricción. Vectores de clonado (plásmidos o virus): vectores en los que la secuencia de ADN es introducida usando una DNA ligasa. Cuando es necesario el fragmento de ADN de interés puede ser liberado del vector por medio de enzimas de restricción. Una vez aislados los genes de interés son incorporados al organismo blanco resultando en un organismo genéticamente modificado (OGM) y esta característica adquirida pasa a ser hereditaria Una vez aislados los genes de interés son incorporados al organismo blanco resultando en un organismo genéticamente modificado (OGM) y esta característica adquirida pasa a ser hereditaria

37 Es posible transferir genes de animales, bacterias o virus a las plantas. Es posible transferir genes de animales, bacterias o virus a las plantas. Se amplían los recursos para el mejoramiento genético. Se amplían los recursos para el mejoramiento genético. Los genes de un organismo que son insertados en otro se denominan transgenes y tienen la capacidad de conferirle a este último una determinada característica. Los genes de un organismo que son insertados en otro se denominan transgenes y tienen la capacidad de conferirle a este último una determinada característica.

38 transgénicos Organismos transgénicos Son excelentes modelos para el estudio de procesos generales básicos como regulación de la expresión génica y la genética molecular del desarrollo y diferenciación celular Son excelentes modelos para el estudio de procesos generales básicos como regulación de la expresión génica y la genética molecular del desarrollo y diferenciación celular Ofrecen la posibilidad de de numerosas enfermedades hereditarias: terapia génica Ofrecen la posibilidad de corrección de numerosas enfermedades hereditarias: terapia génica

39 transgénicos Organismos transgénicos Pueden funcionar como bioreactores para la producción de proteínas valiosas o con propósitos industriales Pueden funcionar como bioreactores para la producción de proteínas valiosas o con propósitos industriales Deben ser capaces de producir la proteína de interés en niveles aceptables sin comprometer el normal funcionamiento de sus células Deben ser capaces de producir la proteína de interés en niveles aceptables sin comprometer el normal funcionamiento de sus células Deben tener la capacidad de transmitir esta característica a las siguientes generaciones Deben tener la capacidad de transmitir esta característica a las siguientes generaciones En el caso de ser un multicelular deben ser capaces de producir la proteína exógena en un órgano definido En el caso de ser un organismo multicelular deben ser capaces de producir la proteína exógena en un órgano definido

40 actual Estrategia actual Acoplar a la secuencia de ADN que codifica para la proteína de interés secuencias de ADN que contengan señales responsables de dirigir niveles de producción (promotor) de la proteína deseada en un órgano específico. Acoplar a la secuencia de ADN que codifica para la proteína de interés secuencias de ADN que contengan señales responsables de dirigir altos niveles de producción (promotor) de la proteína deseada en un órgano específico. Las técnicas para la inserción de ADN en células vegetales (transformación) usadas son: Las técnicas para la inserción de ADN en células vegetales (transformación) usadas son: Infección con Agrobacterium tumefaciens Infección con Agrobacterium tumefaciens Electroporación de protoplastos Electroporación de protoplastos Método biolístico Método biolístico

41 Avances Los primeros experimentos a campo con plantas transgénicas se realizaron en 1986 en Estados Unidos y en Francia. Los primeros experimentos a campo con plantas transgénicas se realizaron en 1986 en Estados Unidos y en Francia. En 1996 y 1997 el número de países que ensayó plantas transgénicas a campo aumentó a 45 habiéndose realizado en 2 años mas de 10 mil experimentos. En 1996 y 1997 el número de países que ensayó plantas transgénicas a campo aumentó a 45 habiéndose realizado en 2 años mas de 10 mil experimentos. Los cultivos más usados fueron: maíz, tomate, soja, batata, algodón, canola. Los cultivos más usados fueron: maíz, tomate, soja, batata, algodón, canola. Las características genéticas introducidas son tolerancia a herbicidas, resistencia a insectos, calidad de producto y resistencia a virus. Las características genéticas introducidas son tolerancia a herbicidas, resistencia a insectos, calidad de producto y resistencia a virus.

42 Clonado de plantas La técnica del clonado in vitro es posible mediante el cultivo de tejidos La técnica del clonado in vitro es posible mediante el cultivo de tejidos Esta técnica se basa en la totipotencialidad de las células vegetales, por medio la regeneración in vitro, vía organogénesis o embriogénesis somática Esta técnica se basa en la totipotencialidad de las células vegetales, por medio de la regeneración in vitro, vía organogénesis o embriogénesis somática

43 Transformación Se producen cambios por inserción de un gen proveniente de otro organismo Se producen cambios por inserción de un gen proveniente de otro organismo La transferencia de DNA/genes de un organismo a otro se realiza sin necesidad de reproducción sexual. La transferencia de DNA/genes de un organismo a otro se realiza sin necesidad de reproducción sexual. La transformación exitosa depende de la incorporación estable del gen nuevo en el genoma de la planta receptora y su subsiguiente transmisión a sucesivas generaciones. La transformación exitosa depende de la incorporación estable del gen nuevo en el genoma de la planta receptora y su subsiguiente transmisión a sucesivas generaciones.

44 Transformación Requerimientos Mecanismo de transferencia del gen Mecanismo de transferencia del gen Mecanismos de transferencia indirecta Mecanismos de transferencia indirecta Mecanismos de transferencia directa Mecanismos de transferencia directa Sistemas de regeneración Sistemas de regeneración

45 Transformación indirecta Mediada por Agrobacterium: Agrobacterium es una bacteria patógena del suelo para dicotiledóneas y algunas coníferas. Agrobacterium es una bacteria patógena del suelo para dicotiledóneas y algunas coníferas. Agrobacterium tumefaciens – crown gall disease (tumors) Agrobacterium tumefaciens – crown gall disease (tumors) Agrobacterium rhizogenes – hairy root disease (hairy roots) Agrobacterium rhizogenes – hairy root disease (hairy roots) Las Monocotiledóneas presentan resistencia natural a Agrobacterium. Las Monocotiledóneas presentan resistencia natural a Agrobacterium.

46 Transformación Agrobacterium tumefaciens & crown gall disease Crown gall disease produce nódulos anormales en raíces. Los árboles jóvenes no crecen, en los árboles adultos la corteza se pudre. Esta bacteria entra al árbol a través de heridas.

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48 Transformación Agrobacterium tumefaciens La enfermedad crown gall resulta de la expresión de genes codificados por un segmento de DNA de la bacteria que se transfiere e integra en forma estable al genoma vegetal La enfermedad crown gall resulta de la expresión de genes codificados por un segmento de DNA de la bacteria que se transfiere e integra en forma estable al genoma vegetal El fragmento de DNA bacteriano contiene genes que producen hormonas cuando se expresan en las células vegetales ocasionando divisiones y crecimiento anormales (tumores). El fragmento de DNA bacteriano contiene genes que producen hormonas cuando se expresan en las células vegetales ocasionando divisiones y crecimiento anormales (tumores). Agrobacterium es un ingeniero genético natural(1983). Agrobacterium es un ingeniero genético natural(1983). Es un mecanismo de transferencia entre reinos Es un mecanismo de transferencia entre reinos

49 Transformación Transformación mediada por Agrobacterium Plásmido Ti: plásmido inductor de tumores (A. tumefaciens) Plásmido Ti: plásmido inductor de tumores (A. tumefaciens) Plásmido Ri: plásmido inductor de hairy roots (A. rhizogenes) Plásmido Ri: plásmido inductor de hairy roots (A. rhizogenes) T-DNA: DNA que se transfiere T-DNA: DNA que se transfiere 1. genes para síntesis de hormonas: codifican para enzimas involucradas en la biosíntesis de auxinas y citoquinias. La expresión de estos genes en la célula vegetal causa la enfermedad de agalla de corona o la formación de hairy roots 2. Secuencias en los bordes: 25 bp direct repeats, borde derecho (RB) y borde izquierdo (LB),a ambos lados del T-DNA. Son los elementos necesarios (en la región del T-DNA ) para dirigir la transferencia del T- DNA.

50 Transformación mediada por Agrobacterium PlásmidoTi o plásmido Ri: Genes de síntesis de opinas: responsables de la síntesis de nuevas opinas. Genes de síntesis de opinas: responsables de la síntesis de nuevas opinas. Opinas: derivados de aminoácidos o azúcares producidos por tejidos vegetales infectados que son por Agrobacterium como única fuente de carbono/nitrógeno. Opinas: derivados de aminoácidos o azúcares producidos por tejidos vegetales infectados que son por Agrobacterium como única fuente de carbono/nitrógeno. Clasificación de los plásmidos Ti y Ri: Plásmidos Ti: plásmidos Nopalina Octopine plasmid Octopine plasmid Agropine plasmid Agropine plasmid Succimanopine plasmid Succimanopine plasmid Plásmidos Ri: plásmidos Manopina Agropine plasmid Agropine plasmid Cucumopine plasmid Cucumopine plasmid

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52 Genes involucrados en la transferencia del T-DNA Localizados en la región T-DNA: 1.Genes de síntesis de hormonas 2. Secuencias de los bordes: LB y RB Localizados en cualquier región del plásmido Ti: 3.Genes de síntesis de opinas 4. Genes de virulencia Localizados en el cromosoma de Agrobacterium (4 loci) Síntesis de fibrillas de celulosa por Agrobacterium para cubrir la superficie de la célua vegetal(irreversible). Clusters de Agro son entrampadas en la red de fibrillas de celulosa. chvA ychvB (linked): síntesis y excreción de 1,2-glucan chvA ychvB (linked): síntesis y excreción de 1,2-glucan cel locus: síntesis de fibrillas de celulosa cel locus: síntesis de fibrillas de celulosa pscA locus: afectan la síntesis de cicloglicanos y ácido succinilglicano pscA locus: afectan la síntesis de cicloglicanos y ácido succinilglicano att locus: afecta proteínas de la superficie celular att locus: afecta proteínas de la superficie celular Algunos de estos loci se encuentran conservados en otras bacterias del suelo que se interasocian con plantas

53 Genes Vir y transferencia de genes T-DNA Las células vegetales se vuelven sensibles a Agrobacterium cuando son heridas. El proceso de transferencia se puede dividir en: En la bacteria: proceso de conjugación bacteriana En la bacteria: proceso de conjugación bacteriana En la célula vegetal: las células heridas producen compuestos fenólicos de bajo PM que actúan como inductores específicos de los genes de expresión vir. En la célula vegetal: las células heridas producen compuestos fenólicos de bajo PM que actúan como inductores específicos de los genes de expresión vir. Acetosyringona (AS), hirdroxi-acetosyringona (OH-AS) Estos compuestos fenólicos actúan a través de dos sistemas para Regular la expresión de los genes vir

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55 Transformación mediada por Agrobacterium Uso del plásmido Ti de Agrobacterium como vector de transformación Uso del plásmido Ti de Agrobacterium como vector de transformación Se remueven los genes para hormonas (desarmado) Se remueven los genes para hormonas (desarmado) Para la transformación de introducen genes en el plásmido Ti Para la transformación de introducen genes en el plásmido Ti Clonado de DNA Clonado de DNA Genes marcadores para selección: de resistencia a antibióticos Genes marcadores para selección: de resistencia a antibióticos Cassetes: Cassetes: Promotor + gen + terminador

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59 Transformación mediada por Agrobacterium Ventajas: Transformación estable Transformación estableDesventajas: No para monocotiledóneas No para monocotiledóneas

60 Aplicaciones de las técnicas de cultivo in vitro

61 Micropropagación Mantiene la identidad genética del material propagado sin introducir ninguna variabilidad genética Mantiene la identidad genética del material propagado sin introducir ninguna variabilidad genética Propagación clonal rápida (floricultura, fruticultura, plantas medicinales, silvicultura) Propagación clonal rápida (floricultura, fruticultura, plantas medicinales, silvicultura) Eliminación de virus ( de meristemas) hibridación o fusión somática (fusión de protoplastos) Eliminación de virus (cultivo de meristemas) hibridación o fusión somática (fusión de protoplastos)

62 Bancos de germplasma Bancos de germplasma Semillas (embriones somáticos recubiertos de gel de alginato que también encapsula nutrientes para el desarrollo del embrión) Semillas sintéticas (embriones somáticos recubiertos de gel de alginato que también encapsula nutrientes para el desarrollo del embrión)

63 a insectos Resistencia a insectos Puede ser obtenida mediante la utilización de inhibidores de proteasas vegetales o a partir de toxinas bacterianas (Bacillus thuringiensis), o gen Bt Puede ser obtenida mediante la utilización de inhibidores de proteasas vegetales o a partir de toxinas bacterianas (Bacillus thuringiensis), o gen Bt Como ejemplos de plantas resistentes a insectos están el maíz, batata y soja transgénicos Como ejemplos de plantas resistentes a insectos están el maíz, batata y soja transgénicos

64 Tolerancia a herbicidas Esta modalidad engloba a la mayor parte de las plantas transgénicas actuales Esta modalidad engloba a la mayor parte de las plantas transgénicas actuales Ejemplos: maíz, eucalipto, soja, caña de azúcar Ejemplos: maíz, eucalipto, soja, caña de azúcar Un ejemplo cotidiano es la Soja Roundup Ready Un ejemplo cotidiano es la Soja Roundup Ready

65 a virus Resistencia a virus Las perspectivas son cada vez mayores a medida que aumentan los conocimientos acerca de fitovirus Las perspectivas son cada vez mayores a medida que aumentan los conocimientos acerca de fitovirus Silenciamiento génico o protección mediada por ARN Silenciamiento génico o protección mediada por ARN Por medio de la tecnología del Agrobacterium tumefaciens o de la biolística y el cultivo de tejidos, es posible introducir en la planta genes de la cápside viral posibilitándose así la adquisición de resistencia por parte de la planta. Por medio de la tecnología del Agrobacterium tumefaciens o de la biolística y el cultivo de tejidos, es posible introducir en la planta genes de la cápside viral posibilitándose así la adquisición de resistencia por parte de la planta.

66 Alteración del color floral Dentro del mercado de la floricultura se abren nuevas perspectivas con el clonado de genes asociados con la coloración de las flores. Dentro del mercado de la floricultura se abren nuevas perspectivas con el clonado de genes asociados con la coloración de las flores. También se abre la posibilidad de modificar la arquitectura de la planta y de las flores, las fragancias y la mayor durabilidad de las flores. También se abre la posibilidad de modificar la arquitectura de la planta y de las flores, las fragancias y la mayor durabilidad de las flores.

67 Obtención de productos y alteración de la calidad nutricional Obtención de nuevos productos y alteración de la calidad nutricional La empresa Calgene produjo aceites ricos en ácido esteárico. La empresa Calgene produjo aceites ricos en ácido esteárico. Se alteró la composición en hidratos de carbono con vistas a la producción de tubérculos de papa, aumento del contenido de almidón y reducción de amilosa Se alteró la composición en hidratos de carbono con vistas a la producción de tubérculos de papa, aumento del contenido de almidón y reducción de amilosa En el año 2000 se la obtención de arroz genéticamente modificado que produce beta- carotenos, precursor de la vitamina A En el año 2000 se informó la obtención de arroz genéticamente modificado que produce beta- carotenos, precursor de la vitamina A

68 Ingeniería metabólica Es posible alterar rutas metabólicas para permitir que las plantas, o sus células, funcionen como bioreactores (reactores biológicos). Es posible alterar rutas metabólicas para permitir que las plantas, o sus células, funcionen como bioreactores (reactores biológicos). Es posible, de esta manera, la producción de sustancias de valor farmacológico, como por ejemplo, vacunas y biofármacos. Es posible, de esta manera, la producción de sustancias de valor farmacológico, como por ejemplo, vacunas y biofármacos. La manipulación del metabolismo secundario de vegetales, por medio de la transformación genética, promete ser una de las contribuciones más importantes de la ingeniería genética a la industria. La manipulación del metabolismo secundario de vegetales, por medio de la transformación genética, promete ser una de las contribuciones más importantes de la ingeniería genética aplicada a la industria.

69 La sobre expresión constitutiva de genes involucrados en la ruta biosintética de metabolitos secundarios podrá aumentar significativamente la cantidad de compuestos útiles producidos en plantas. La sobre expresión constitutiva de genes involucrados en la ruta biosintética de metabolitos secundarios podrá aumentar significativamente la cantidad de compuestos útiles producidos en plantas. Los avances en esta área permitirán aumentar las productividad de metabolitos secundarios obtenidos en cultivos in vitro con la consiguiente reducción de costos de producción o logrando la producción de nuevos compuestos. Los avances en esta área permitirán aumentar las productividad de metabolitos secundarios obtenidos en cultivos in vitro con la consiguiente reducción de costos de producción o logrando la producción de nuevos compuestos.

70 Ejemplos de metabolitos secundarios producidos por cultivos in vitro de células vegetales Metabolito secundario Cultivo productor Acido rosmarínico Anchusa officinalis Ajmalicina Catharanthus roseus Berberina Coptis japonica Digoxina Digitlis lanata Ginsenósidos Panax ginseng Hiosciamina Hyoscyamus niger Nicotina Nicotiana tabacum Piretroides Pyrethrum cinerea Shikonina Lithospermum erytrorhizon Taxol Taxus cuspidata Vinblastina Catharanthus roseus

71 Biotransformación Se usan para realizar reacciones bioquímicas sencillas en las que no se necesita diferenciación ni crecimiento celular Se usan para realizar reacciones bioquímicas sencillas en las que no se necesita diferenciación ni crecimiento celular Hidroxilación estereoespecífica en posición 12- de la - metil digoxina, glicósido cardiotónico, por células de Digitalis lanata. Hidroxilación estereoespecífica en posición 12- de la - metil digoxina, glicósido cardiotónico, por células de Digitalis lanata.

72 Diferencias más importantes en el cultivo de células microbianas, animales y vegetales Característica Células microbianas Células animales Células vegetales Tamaño 1-5 μm μm3 Forma de crecimiento Células individuales Individuales o adheridas a superficies En grupos Tiempo de generación 1 hora 20horas >24 horas Sensibilidad al esfuerzo cortante bajaaltaAlta Requerimiento de oxígeno Hasta 180 mmol l -1 h mmol l -1 h mmol l -1 h -1 Requerimientos nutritivos simplescomplejosSimples Población celular alcanzada en cultivo líquido células ml células.ml -1

73 Molecular farming

74 Qué es? El Molecular farming es la producción de proteínas de alto valor agregado en plantas. Cómo se hace? Se usa el mejoramiento genético para introducir y expresar genes que codifican para proteínas de alto Por qué en plantas? En las plantas las proteínas se pueden producir a muy bajos costos y en grandes cantidades. También son flexibles y pueden producir una gran variedad de proteínas. Transformación 1 El disco de la hoja es sumergida en una suspensión bacteriana. LA bacteria "Trojan Horse" infecta los bordes de la hoja y en este proceso integra los genes que codifican para la proteína de interés en el genoma vegetal. 2 & 3 Después de la infección los discos se ubican en medio de selección para las células que portan el gen de la proteína y regeneran en plántulas. Luego de aproximadamente seis semanas en medio de selección, un gran número de plántulas que portan el gen de interés son visibles en los bordes. 4 se remueven las plántulas de los bordes de hojas y se colocan en cajas plásticas transparentes con medio de enraizamiento. 5 Las plántulas se colocan en macetas y crecen hasta producir semillas. Estas semillas pueden ser usadas para la producción en gran escala de proteínas de interés farmacéutico.. Tráfico Proteico 6 Luego de la traducción, la proteína se moverá a través del retículo endoplásmico y el aparato de Golgi para su procesamiento, plegado y glicosilación.. Producción en campo 7 Luego de la cosecha el tejido que acumula la proteína puede ser directamente consumido o la proteína puede ser extraída para un uso posterior.

75 Proteínas obtenidas por Molecular Farming Reactivos de diagnóstico Reactivos de diagnóstico Vacunas animales Vacunas animales Alimentos animales Alimentos animales Enzimas industriales Enzimas industriales Productos farmacéuticos para el hombre Productos farmacéuticos para el hombre

76 Ventajas del Molecular Farming para la producción de proteínas de uso farmacéutico y enzimas industriales 1. Riesgos sanitarios reducidos de contaminación por patógenos 2. Pueden ser escalados a costos relativamente bajos 3. Son capaces de modificaciones postraslacionales proteicas 4. Requieren de infraestructuras limitadas (para cultivo, cosecha, almacenamiento y procesamiento del material vegetal) 5. No se requiere, en muchos casos, la purificación de la proteína (por ej. Procesamiento de alimentos, aditivos alimenticios, fermentaciones y vacunas orales)

77 Valor de mercado de los productos proteicos del molecular farming 1. La demanda del mercado de proteínas para la industria farmacéutica se incrementa 2. Las proteínas expresadas en plantas resultan al menos 10 veces más baratas que las expresadas en otros sistemas (por ej, microorganismos) 3. El costo de vacunas expresadas en plantas, anticuerpos o proteínas puede ser veces menor

78 Ventajas de los vegetales como bioreactores Las plantas son los productores más eficientes de proteínas Las plantas son los productores más eficientes de proteínas son bioreactores escalables son bioreactores escalables presentas ventajas en cuanto a costos presentas ventajas en cuanto a costos Las células vegetales son similares a las humanas en cuanto a: Las células vegetales son similares a las humanas en cuanto a: Maquinaria para síntesis proteica Maquinaria para síntesis proteica Pauta de lectura del código genético Pauta de lectura del código genético Ensamble, plegamiento y secreción de proteínas complejas Ensamble, plegamiento y secreción de proteínas complejas

79 Anticuerpos recombinantes en vegetales Plantibodies

80 Los Anticuerpos producidos en plantas pueden ser utilizados en especialidades medicinales? Los anticuerpos producidos en plantas son seguros y efectivos. Los anticuerpos producidos en plantas son seguros y efectivos. Los glicanos vegetales pueden ser inyectados. Los glicanos vegetales pueden ser inyectados. Son para administración oral, inhalatoria o tópica. Son para administración oral, inhalatoria o tópica. Las regulaciones de FDA y USDA están evolucionando? Las regulaciones de FDA y USDA están evolucionando?

81 Etapas del proceso 1. Clonado y expresión de los genes de interés 2. Regeneración y selección de las plantas 3. Recuperación y purificación de la proteína 4. Caracterización del producto final

82 Introducción de genes de anticuerpos en plantas 1. Transformación con Agrobacterium. 2. Microinyección de cDNA en núcleo antes de reimplantarlo en una célula anucleada (Stieger et al. 1991) 3. Expresión transiente en hojas (Schouten et al, 1996) 4. Métodos biolísticos

83 Comparación de Anticuerpos derivados de Plantas y Cultivos Animales Secuencia Peptídica: idéntica Secuencia Peptídica: idéntica Afinidad: idéntica Afinidad: idéntica Tipos de Anticuerpos: El sistema vegetal es más versátil Tipos de Anticuerpos: El sistema vegetal es más versátil Pueden producir isotipos incluyendo IgA secretoras Pueden producir isotipos incluyendo IgA secretoras Procesamiento Post-transduccional: diferente Procesamiento Post-transduccional: diferente núcleo de glicano idéntico, azúcar terminal diferente núcleo de glicano idéntico, azúcar terminal diferente Antigenicidad & clearance: aparentemente idénticos Antigenicidad & clearance: aparentemente idénticos

84 Anticuerpos efectivos producidos en vegetales Anti-Streptococcus mutans (Guys 13) Anti-Streptococcus mutans (Guys 13) Previene caries dental en humanos Previene caries dental en humanos Las sIgA 10X de plantas son más estables que IgG Las sIgA 10X de plantas son más estables que IgG Nature Medicine 1998 Nature Medicine 1998 Anti-Herpes simplex virus (HSV8) Anti-Herpes simplex virus (HSV8) Previene la transmisión del herpes vaginal Previene la transmisión del herpes vaginal Probado en ratones con PAbs de arroz y soja Probado en ratones con PAbs de arroz y soja Nature Biotechnology 1998 Nature Biotechnology 1998

85 Aplicaciones de la Inmunomodulación Estudiar la función de un antígeno o incluso de un epitope en las plantas Estudiar la función de un antígeno o incluso de un epitope en las plantas Modificar caracteres agronómicos Modificar caracteres agronómicos Inmunizar a la planta contra un determinado agente. Inmunizar a la planta contra un determinado agente.

86 Inmunomodulación de blancos endógenos Actividad de fitohormonas Actividad de fitohormonas ABA (scFv en ER de tabaco) ABA (scFv en ER de tabaco) Giberellina (A 19/24 scFv en tabaco) Giberellina (A 19/24 scFv en tabaco) Inactivación de producto final en la ruta biosintética de una hormona (ABA) Inactivación de producto final en la ruta biosintética de una hormona (ABA) Modulación de la actividad del receptor hormonal (scFv contra fitocromo) Modulación de la actividad del receptor hormonal (scFv contra fitocromo) Inhibición enzimática (DFR en Petunia hybrida) Inhibición enzimática (DFR en Petunia hybrida)

87 Inmunización intra y extracelular Tabaco que expresa anticuerpos contra la cubierta viral proteica de TMV Tabaco que expresa anticuerpos contra la cubierta viral proteica de TMV Nicotiana benthamiana que expresa anticuerpos contra el virus BNYVV Nicotiana benthamiana que expresa anticuerpos contra el virus BNYVV Tabaco que expresa scFv contra factores de infectividad de fitoplasmas y espiroplasmas Tabaco que expresa scFv contra factores de infectividad de fitoplasmas y espiroplasmas Tabaco resistente a nematodes (IgM contra Meloidogyne incognita) Tabaco resistente a nematodes (IgM contra Meloidogyne incognita)

88

89 Anticuerpos contra nematodes Genes que codifican para enzimas blanco: p.ej celulasas las cuales han sido clonadas de M. incognita así como de otros nematodes de este tipo. Estas enzimas desempeñan un papel fundamental en la migración hacia raíz y son un excelente punto de partida para la selección de anticuerpos.Se han generado también anticuerpos que bloquean el inicio del ciclo celular para evitar la inducción de las células de alimentación por el nematode. Genes que codifican para enzimas blanco: p.ej celulasas las cuales han sido clonadas de M. incognita así como de otros nematodes de este tipo. Estas enzimas desempeñan un papel fundamental en la migración hacia raíz y son un excelente punto de partida para la selección de anticuerpos.Se han generado también anticuerpos que bloquean el inicio del ciclo celular para evitar la inducción de las células de alimentación por el nematode. Se han obtenido y caracterizado por su capacidad para inhibir sus blancos anticuerpos contra las proteínas de TSWV :N (importante para la replicación viral), G1/G2 (captación por thrips) y NSm (distribución en la planta). Se han obtenido y caracterizado por su capacidad para inhibir sus blancos anticuerpos contra las proteínas de TSWV :N (importante para la replicación viral), G1/G2 (captación por thrips) y NSm (distribución en la planta). Se han hallado motivos estabilizadores que aseguran un nivel de expresión significativo de los anticuerpos y sus fragmentos en el citosol de la célula vegetal. Se han hallado motivos estabilizadores que aseguran un nivel de expresión significativo de los anticuerpos y sus fragmentos en el citosol de la célula vegetal.

90 Perspectivas 1. Regulación metabólica. 2. Plantas con resistencia a virus mediada por plantibodies 3. Reducción del uso de pesticidas: resistencia a pestes e insectos 4. Modulación de antígenos (DH4R) 5. Estudio del rol fisiológico de hormonas. 6. Remoción de polutantes de suelos (Ac contra tóxicos orgánicos, compuestos potencialmente carcinogénicos, herbicidas) 7. Remoción de polutantes de aguas ( inmovilización el Ac en soporte sólido) 8. Biofarming: producción de moléculas industriales o farmacéuticas basada en cultivos vegetales. (1% TSP: expresión costo-efectiva). Análisis de especie, órgano. 9. diagnóstico

91 Downstream processing Importante para utilización ex planta Importante para utilización ex planta Alcaloides y otras sustancias tóxicas encarecen y dificultan la purificación (tabaco) Alcaloides y otras sustancias tóxicas encarecen y dificultan la purificación (tabaco) Ausencia de virus patógenos, priones y otras sustancias típicas de sistemas de producción animales. Ausencia de virus patógenos, priones y otras sustancias típicas de sistemas de producción animales. Posibilidad de usar un tejido vegetal comestible para inmunidad a nivel de mucosas (purificación) Posibilidad de usar un tejido vegetal comestible para inmunidad a nivel de mucosas (purificación)

92 Cuál es el desafío? Desarrollo de drogas para el tratamiento de ciertas enfermedades; las proteínas son la clase en más franco desarrollo para la prevención y tratamiento de enfermedades. Desarrollo de drogas para el tratamiento de ciertas enfermedades; las proteínas son la clase en más franco desarrollo para la prevención y tratamiento de enfermedades. Desarrollo de resistencia contra patógenos (microorganismos y patógenos más complejos como nematodes) Desarrollo de resistencia contra patógenos (microorganismos y patógenos más complejos como nematodes) Análisis y manipulación de rutas biosintéticas. Análisis y manipulación de rutas biosintéticas. Seguridad y Eficiencia Seguridad y Eficiencia Ética Ética


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