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Proteínas ENZIMAS CATALIZADORES ¿Que es un catalizador?

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Presentación del tema: "Proteínas ENZIMAS CATALIZADORES ¿Que es un catalizador?"— Transcripción de la presentación:

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2 Proteínas ENZIMAS CATALIZADORES ¿Que es un catalizador?

3 Ejemplo: Un catalizador es un compuesto que aumenta la velocidadde una reacción química sin ser destruido o incorporado al producto (IUPAC) ¿Que es un catalizador?

4 Reacciones unimoleculares S P pendiente de la tangente a la curva = - [S]/ t ¿Cómo se define la velocidad de reacción? ¿De qué depende? ¿Cuánto vale? ¿Cómo y cuando se calcula? ¿Qué unidades tiene? minutos Molar Tres casos

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6 - El Plegamiento proporciona un andamio que permite a ciertos aminoácidos (catalíticos) estar en la posición espacial adecuada para llevar acabo su función, además, genera un medio ambiente adecuado para la captura de los sustratos.

7 La posición espacial relativa de los elementos catalíticos se mantiene aunque la secuencia de aminoácidos cambie.

8 Cholinesterase Dienelactone hidrolase Lipase/Cutinase Thioestearase Serine Carboxypeptidase Prolyl Imino/Oligo peptidase Bromoperoxidase Haloalkane dehalogenase Fluoroacetate dehalogenase Epoxide hydrolase Hydroxynitrile lyase C-C Hydrolase 2,4-Dioxygenase Amilasa TIM barrels

9 - Flexibilidad: La tapa del sitio activo de algunas enzimas presenta mobilidad. - Sitios Alostéricos: Otros sitios pueden activar a la proteína desde regiones alejadas del sitio activo. - Cambios conformacionales: pueden suceder al unir un sustrato. Glucocinasa Glucosamina 6-Fosfato-desaminasa

10 - Aminoácidos catalíticos: Son los involucrados en la función. - Están directamente involucrados en la catálisis. - Ejercen un efecto en otro residuo o molécula de agua que está directamente relacionado con la catálisis. - Estabilizan el estado de transición. - Ejercen algún efecto en el sustrato o cofactor que ayuda a la catálisis. - Aminoácidos del sitio activo no catalíticos: Participan en el reconocimiento del sustrato y lo colocan en la orientación correcta. El tamaño de una enzima en relación con su función

11 Aminoácidos del sitio activo no catalíticos que estabilizan al Pirofosfato. Aminoácidos del sitio activo no catalíticos que estabilizan a los sustratos. Aminoácidos catalíticos Arg59, Ser130, Lys 159 Mg ++ Sitio Activo de la Tiamina Fosfato Sintasa

12 Lipases catalyse the hydrolysis of triglycerides: The active site of lipases contain 3 essential amino acids: asp, his and ser. Lipases have ~250 other amino acid residues. Why? Tripeptide asp-his-ser enhances the hydrolysis rate of triglycerides by a factor 2-10; lipases by a factor How do they do that?

13 Why are lipases such active enzymes? Exact alignment of the asp, his and ser side chains Stabilisation of the intermediate C-O Ensure the correct asp, his and ser Stabilise against proteolysis and denaturation

14 La triada catalítica SER-HIS-ASP Serin- proteasa de Bacillus lentus

15 Ejemplo de Catálisis, una Serina proteasa

16 Analysis of Catalytic Residues in Enzyme Active Sites JMB (2002) 324,

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20 Conclusiones: - Los aminoácidos mayoritariamente catalíticos son histidina, cisteina, ácido glutámico, ácido aspártico, arginina, lisina. - Están muy poco expuestos al solvente, a pesar de su polaridad. - Casi todos están formando puentes de hidrógeno. - Tienen una movilidad muy baja en comparación con los demás aminoácidos. - La función de un aminoácido catalítico es estabilizar un intermediario del estado de transición, actuar como nucleófilo o ser donador o aceptor de protones.

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23 Catálisis: Leyes Generales de la Catálisis Catalizadores biológicos Velocidades más elevadas de reacción Condiciones de reacción mas suaves Mayor especifidad de reacción Capacidad para la regulación

24 Reactivos Productos Energía de activación (con enzima) Energía de activación (sin enzima) Sin enzima Con enzima Nivel de energía

25 (S) C 12 H 22 O 13 + H 2 O (G) C 6 H 12 O 6 + (F) C 6 H 12 O 6

26 Reaction equations and reaction rate A reaction like A B may run via route 1; the rate is determined by the magnitude of E a (1) Alternatively, the reaction runs via an intermediate, like 2. The rate is determined by the slowest step (= the one with the highest E a ). Alternatively, the reaction can run via more intermediates, like 3 A B 1 E 2 3 Ea(1)Ea(1)

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28 Features of a catalyst: Makes an alternative reaction path in which less activation energy is needed. Equally increases the rate of the back and forth reaction reaction catalysis has no effect on equilibrium position! S P k1k1 k --1 k1/k-1 = Peq/Seq = Keq Keq = k1/k-1 v = k1 S – k-1P v = 0 = k1 Seq – k-1Peq No Enzimática k 1 = min -1 k -1 = min -1 k 1 = 10 min -1 k -1 = min -1 Enzimática

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30 ¿POR QUE SUCEDE UNA REACCIÓN? Teoría de las colisiones. En gas y líquidos, frecuencias muy altas: A(g) + 1 Atm y 25 C colisiones /seg cm3 A A + B menor frecuencia A+B+C de colisiones Explica la proporcionalidad entre velocidad y concentración

31 Arrhenius (1889) Sólo las que alcanzan cierto nivel de energía. Las activadas o exitadas; sólo las que adquieren….. T E cinética velocidad choques de las moléculas v S v k S v k S n Donde k es la constante de velocidad de reacción y n es el orden de la reacción. Orden y molecularidad: ¿es lo mismo? ¿Unidades de la constante de velocidad? Pero es obvio que no todas las que chocan reaccionan: ¿porqué?

32 Example: hydrolysis of alkyl bromides R-Br + OH – R-OH + Br – (S N 2 reaction) Reaction takes place by collision of the particles RBr and OH –, implying that the reaction rate is directly proportional to [RBr] and [OH – ]. Alternative: These are the most common reaction situations: - bimolecular:2 particles collide and react - monomolecular:1 particle dissociates or reacts v = k (R-Br)(OH-) v = k 1 (R-Br) k 2 + R-Br

33 Energía Cinética Moléculas Energía de activación

34 k = A e - G++/RT Las energía de activación ( G ++ ) de las reacciones enzimáticas son del orden de 6000 a 15,000 cal/mol Las energía de desactivación o desnaturalización ( G ++ ) de activación una enzima son del orden de 50,000 a 150,000 cal/mol (a bajas temperaturas son estables pero al aumentar la T rápidamente se desactivan. ln k = ln A – G ++ RT k

35 ¿En cuanto aumenta la velocidad de reacción del proceso de Descomposición del peróxido de hidrógeno, H 2 O 2 H 2 O + O 2 si la energía de activación de la reacción natural es de 76 KJ/mol, mientras que la reacción con catalasa es de 30 KJ/mol? Si una reacción tiene una energía de activación de 6,000 cal/mol y otra de 60,000 cal/mol ¿Cómo influye en cada una de ellas el aumento de la temperatura? (cada 10 o C)

36 Temperatura ( o C) Velocidad relativa 6,000 cal/mol Velocidad relativa 60,000 cal/mol x

37 El caso de la orotidina-5´-monofosfato decarboxilasa

38 Determination of reaction rates Determination of the concentration of a compound (substrate, product), as a function of time. The method used depends on the properties of the compound. Chromatography –Example:

39 GC analysis of the esterification of racemic menthol with vinyl acetate, catalysed by Candida rugosa lipase, in diisopropyl ether as the solvent. I.S., internal standard (decane). An enantioselective GC column is used, so the enantiomers are separated. There is only one product peak because the reaction is stereoselective.

40 Another example: the chlorination of barbituric acid (1) by chloroperoxidase from Caldariomyces fumago

41 UV spectroscopy Example: chlorination of 1 by chloroperoxidase Can be done quantitatively through Lambert-Beers law: A =.c.d

42 IR spectroscopy Example: oxime formation Problem: not quantitative Polarimetry (only for chiral compounds) Example: hydrolysis of sucrose: C 12 H 22 O 11 + H 2 O C 6 H 12 O 6 + C 6 H 12 O 6 sucrose + water glucose + fructose [ ] D 20 = +66,5° [ ] D 20 = +52° [ ] D 20 = –92° (together [ ] D 20 = –40°) Can be done quantitatively

43 Titration Example: ester hydrolysis Ester + water acid + alcohol Excellent for quantitative measurements; hooked up to computer. ml base added vs time; slope = reaction rate

44 ¿Que tipo de reacciones catalizan? C 1. _. _. _ C 2. _. _. _ C 3. _. _. _ C 4. _. _. _ C 5. _. _. _ C 6. _. _. _

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46 La entalpía es una medida del contenido de calor de una sustancia. Cada sustancia pura posee entalpía, o sea, una cierta cantidad de energía asociada en un estado particular de P y T Es la energía que puede ser transferida en forma de calor cuando el proceso se realiza a presión constante. Lo que puede determinarse es el cambio en el contenido de calor de las substancias: H = H (final) – H (inicial) Los signos matemáticos aplicados a los cambios en entalpía se interpretan como sigue: H positivo; se añade calor al sistema (proceso endotérmico) H negativo; el sistema libera calor (proceso exotérmico) Por lo general, los valores de H se reportan a 25oC y 1 atmósfera de presión. Esto es lo que se conoce como un estado a condiciones estándar y se representa por el símbolo Ho. El calor de reacción es el cambio en entalpía asociado a esa reacción y equivale a: Ho reacción = H productos – reactivos NO SON CRITRIOS DE ESPONTANEIDAD ES UN PRINCIPIO DE CONSERVACIÓN. Es energía potencial que se libera al transformar sustratos en productos. 1ª Ley de la Termodinámica: La energía total de un sistema y sus alrededores es constante E = Ef – Ei = Q (calor absorbido - W (trabajo realizado) por el sistema) E = H - P V En sistemas biológicos V=0 E = H

47 Reacciones endotérmicas X* Sustrato Producto a > 0 Activación endotérmica Hd < 0 Hr > 0

48 Reacciones exotérmicas X* Sustrato Producto Ha > 0 Activación endotérmica Hd < 0 Hr < 0 Hr < 0 exotérmico Ha > 0 activación endotérmica Hd < 0 exotérmico Hr = Ha - Hd Pero no es un criterio de espontaneidad de la reacción: La ley que prescribe la dirección del flujo de energía es la segunda ley de termodinámica. Hr > 0 endotérmico Hr < 0 exotérmico

49 El Concepto de Entropía Una definición amplia de entropía es que ésta es una medida del grado de desorden de un sistema. Esto se puede interpretar también en términos de probabilidad: un estado de desorden es más probable que un estado ordenado. El caso de la caja de canicas blancas y la de canicas negras. El calor no fluye entre dos objetos a menos que estén a diferentes temperaturas. S univ = S sistema + S alrededores Si S univ > 0 El sistema procede de manera espontánea del estado a al estado b. La entropía del universo tiende a aumentar Si S univ = 0 El sistema está en equilibrio y no se moverá de ahí espontáneamente. Si S univ < 0 El sistema procede espontáneamente pero en la dirección inversa, es decir de b a a Una reacción ocurre por la tendencia a buscar un estado de mínima energía y por la tendencia a buscar aumentar el desorden.

50 El Concepto de Energía Libre El Hr es el cambio de energía que acompaña a una reacción – medida por calorimetría-. ¿Cuál es la máxima cantidad de energía que podemos extraer de la reacción? La Energía disponible: G reacción Si G > H o G < H ¿se cumple la primera ley? 1878 Gibbs: Una nueva función que resulta de la 1a y la 2a leyes: G = – S El cambio de energía = cambio de energía – cambio de energía Libre (a P y T ctes) total de organización eg. AgNO 3 + HCl AgCl (s) + HNO 3 (los sólidos tienen una estructura más ordenada) Kcal/mol G= Kcal/mol - G = -2.5 Kcal/mol Esta es energía que no puede usarse para generar trabajo, pues no esta disponible; es usada para aumentar el orden: T S (el cambio de entropía en el proceso es negativo)

51 Si S > 0 mayor desorden G < H (aporte entrópico a la energía disponible) Si S H (consumo de energía para ordenamiento) Es la combinación de G y H lo que determina la espontaneidad Criterio de espontaneidad: G < 0 proceso espontáneo G = 0 proceso en equilibrio G < 0 proceso no espontáneo Para una reacción A + B C + D en cualquier momento: G = Go + RT ln [C][D]/[A][B] donde Go es la energía libre estandar (pH 7, 1atm, 25oC) y función de la naturaleza de los reactivos. En el equilibrio: G = 0 de donde: Go - RT ln [C] eq [D] eq /[A] eq [B] eq Go - RT ln K eq

52 Go Kcal/mol KJ/molKeq

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56 Catálisis ácido-básica La catálisis ácida general consiste en la transferencia de un protón desde un residuo de la enzima, que se comporta como un ácido de Bronsted, al sustrato o intermediarios de la reacción, disminuyéndose así la energía libre del estado de transición La catálisis básica general consiste en la transferencia de un protón desde el sustrato o intermediarios de la reacción a un residuo de la enzima, que se comporta como una base de Bronsted, disminuyéndose así la energía libre del estado de transición Si se dan ambos tipos de catálisis se tiene una catálisis ácido-básica concertada a)Sin catalizar b)B)Catális ácida general c)Catális básica general Muchas reacciones de importancia bioquimica son suceptibles a catálisis ácido/ base: hidrólisis de peptidos y de ésteres, del grupo fosfato, tautomerizaciones, adiciones de grupos carbonilo…. Tautomerización ceto-enol

57 Catálisis electrostática Ocurre cuando la enzima estabiliza intermediarios o estados de transición de la reacción por neutralización de cargas gracias a la disposición espacial en el sitio activo de residuos con carga opuesta En otros casos la distribución de cargas en el sitio activo sirve para guiar a sustratos cargados o polares a sus sitios de unión Es llevada a cabo por metaloenzimas que contienen iones metálicos fuertemente unidos ( metales de transición como Fe 2+, Fe 3+, Cu 2+, Zn 2+, Mn 2+ o Co 3+ ) o por enzimas activadas por metal que fijan débilmente a los inoes metálicos en solución (iónes metálicos alcalinos como Na +, K +, Mg 2+ o Ca 2+ ) La funcion de los iones metálicos en la catálisis enzimática es –Mediar reacciones de óxido-reducción –Unir y orientar de los sustratos –Estabilizar cargas negativas –Promover la catálisis nucleofílica mediante la ionización del agua

58 Sitio activo de la anhidrasa carbónica humana. La flecha apunta hacia la cavidad del sitio activo Las moléculas ligadas de agua, tienen un carácter mas ácido.

59 Catálisis covalente En este caso se incrementa la velocidad de la reacción por la formación transitoria de un enlace covalente entre un residuo de aminoácido de la enzima y el sustrato. La catálisis covalente consiste en tres estadíos sucesivos: –Ataque nucleofílico de la enzima sobre el sustrato (formación del enlace covalente) –Toma de electrones por el catalizador u otro sustrato (formación del producto) –Separación del producto de la enzima (ruptura del enlace covalente, generalmente por hidrólisis)

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61 Mecanismo de reacción de la amiloglucosidasa

62 El más importante: Catálisis a través de la fijación de un estado de transición a la enzima, con mayor afinidad a la enzima que el sustrato o el producto. En conjunción con los mecanismos antes descritos. La enzima distorsiona al sustrato hasta llevarlo a la geometría del estado de transición, en la que no encajaría el sustrato sin distorcionar.

63 Resumen sobre las estrategias de las enzimas como catalizadores Reducen la energía de activación de la reacción. i.Optimizan la posición de los residuos catalíticos respecto al sustrato. ii.Promueven la proximidad entre reactantes. iii.Desestabilizan los estados basales. iv.Estabilizan el estado de transición.

64 What kinds of catalysts are there around? Organic Inorganic Biological (biocatalyst) Other way of subdivision: Homogeneous = freely dissolved in solution –organic catalyst –organometallic complex –enzyme in water Heterogeneous = solid, in liquid or gaseous environment –inorganic catalyst (e.g. zeolite) –immobilised enzyme –enzyme in an organic solvent


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