Descrioción anatómica del

Presentación del tema: "Descrioción anatómica del"— Transcripción de la presentación:

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2 Descrioción anatómica del
caracol Purpura panza,empleado Por los tejedores mixtecos

3 Source: Natural & Synthetic Organic & Inorganic Vegetal, Animal, Microbial 1856. Discovery of mauve by Perkin (purpure of Tyre) 1906. review of 80 commercial products (30 never tested before, 26 with mixed results. Only 7 were approved.

4 Impact of Biotechnology on the current colorant Industry
Microbial processes Monascus purpureus (polyketide pigments) Phaffia rhodozyma (Astaxanthin) Spirulina maxima (Phycyanin) Dunallella salina (b-carotene) Extraction from seeds and flowers Marigold flowers (lutein) Crocus sativus (saffron; a crocin) Bixa orellana (achiote) Extraction from waste products crawfish, red crab, shrimp (Astaxanthin) Enzymatic process resolution of zeaxanthin Tissue culture Lithospermum eryhrorhizon (shikonin) Genetic Engineering Escherichia coli (indigo)

5 CAROTENOIDES Uno de los grupos de pigmentos naturales mas distribuidos y diversos en la naturaleza. >600 estructuras conocidas. Algunas especies los sintetizan de novo mientras que otras, particularmente animales, solo capaces de absorberlos y metabolizarlos. Síntesis en la naturaleza de unos 100 millones de toneladas anuales Carotenos: C40 cadenas hidrocarbonadas (generalmente anaranjados a rojizos) Xantophylls: Sus derivados oxigenados (generalmente amarillos) De los conocidos, un 10% tiene valor como vitamina A . Además del beta-caroteno, los más importantes entre ellos son el alfa-caroteno y la b eta-criptoxantina. La condición fundamental para que tengan actividad vitamínica es que tengan cerrado y sin oxidar al menos uno de los anillos de los extremos de la estructura. Licopeno, zeaxantina y luteína no tienen valor como vitamina A, aunque son muy importantes como pigmentos, y pueden tener también actividad como antioxidantes.

6 Annato (Bixa orellana L)

7 Bixin (Apocarotenoide)
Achiote (Mexico), Urucum (Brasil). también: roucou, onato, bija, orlean, … Extracción tradicional en proceso acuoso a alta temperatura Bixin es soluble en grasa pero no en agua; tratada con alcali, Se hidroliza el ester metílico para producir: norbixin, (dicarboxilic) que es soluble en agua.

8 Method of removing pigment from annatto seed
United States Patent EXAMPLE Bixa seeds (36 seeds, approximately 2.5 g), harvested one day earlier near San Isidro, Costa Rica, Placed in a 250 ml flask with 60 ml of water and 0.1 g of Spark-L (a pectinase produced by Miles Laboratories, Elkhart, Ind., containing polygalacturonase and pectinesterase). The flask was stirred occasionally over a period of 18 hours at ambient temperature (22°-25° C.). The contents of the flask had a good odor with no indication of fermentation having occurred. The aqueous dispersion of the annatto was decanted from the seeds. As a control, the procedure described above was repeated without addition of enzyme. Removal of Pigment Treatment From Seed (%) : Water & pectinase 70% Water (control) 10%

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11 MERCADO DE ALGUNOS CAROTENOIDES
Astaxantina (4-5 veces más eficiente) Astaxanthin is produced by microalgae, yeast, salmon, trout, krill, shrimp, crayfish, crustaceans, and the feathers of some birds. $ US/Kg Salmón: mg/Kg alimento (10-15% costo dieta) astaxanthin MERCADO DE ALGUNOS CAROTENOIDES capsanthin b-Caroteno: sintético: $750 US/Kg natural: $1800 US/Kg ß-carotene Cenpazuchil lutein zeaxanthin                                                                                              Cantaxantina: $1500 US/Kg canthaxanthin

12 Amounts of astaxanthin found in different organisms[7]
Natural Astaxanthin Sources Astaxanthin Concentration(ppm) Salmonids Plankton Krill Arctic shrimp Phaffia Yeast Haematococcus pluvialis ~ 5 ~ 60 ~ 120 ~ 1200 ~ 8000 ~40,000 Haematococcus pluvialis (0.5-2% dry weight) Phaffia rhodozyma Adonis aestivalis ( mg/flower) Brevibacterium lacticola

13 INDIGO The world largest selling textile dye (by vol): 13, 000 ton/year with a value of $200 million dollars. From Mollusks genus Murex European woad plant: Isatis tinctoria Asian: Indigofera tinctoria 1883 Adolf von Baeyer (chemical structure) Nobel prize. 1897 BASF--- chemical synthesis Genencor recombinant E. coli with 9 genes cloned. Genencor indigo: more expensive than synthetic product

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17 Cochineal: the best natural pigment (carminic acid)
Insects of the families: Coccoides Aphidoides Porphyropera hameli: (Armenian Re) grows in grasses of Azerbaijan Kermococcus vermilis: (Kermes: grows in oaks) Margarodes polonius: (roots of a grass in various trees in India & Malaysia) Dactylopius coccus: (cacti: Opuntia)

18 80,000 – 100,000 insects/Kg of raw dried cochineal (22% of their dry weight)
Today’s production only a small fraction of thet in XVI-XIX centuries (eg. Canary islands alone produced 3000 ton in 1875). Extracted with hot water Treatment with protease ----- “carmines of cochineal”. Strawberry ---- blackcurrent.

19 According to the World Health Organization, dietary vitamin A deficiency (VAD) causes some 250,000 to 500,000 children to go blind each year. More than half those who lose their sight die within a year. VAD compromises the immune systems of approximately 40 percent of children under five in the developing world, greatly increasing the risk of severe illnesses from common childhood infections. VAD is most severe in Southeast Asia and Africa. has become a staple food in many African countries. Globally, rice grain is the world's most important source of human food-feeding more than half of the world's population. Rice is a good provider of calories and protein, but rice scientists have long recognized its micronutrient deficiencies. Milled white rice contains essentially no beta-carotene and unmilled brown rice contains a very small amount. Public rice research institutions in the Philippines, Vietnam, India, Bangladesh, China and Indonesia are in various stages of leading efforts to develop locally adapted Golden Rice varieties.*

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22 LOS PARADIGMAS En el arroz no se expresa la Fitoeno sintasa. La primera variedad tenía el gene del narciso y la fitoeno desaturasa de la bacteria Erwinia pseudonarcissus. La nueva variedad tiene la sintasa del maíz y contiene mas de 30mg de b-caroteno por g de arroz.

23 lycopene More than 250 million sub-Saharan Africans rely on the cassava, a starchy tuber native to South and Central America, as their staple food. Cassava supplies 38.6% of the caloric requirements in some parts of Africa, where hunger and nutrient deficiencies grip the populace and more than 40% of global cassava production takes place. Launched in July 2005 with $7.5 million from the Bill and Melinda Gates Foundation’s Grand Challenges in Global Health Initiative, the program’s overarching goal is to develop what essentially amounts to a super-charged cassava plant variety—one with increased levels of iron, zinc, protein, vitamins, and resistance to the cassava mosaic and brown streak viruses plaguing African farmers.

24 Cassava ß-Carotene is a dietary precursor of vitamin A that is synthesized by the methylerythritol phosphate (MEP) pathway in plastids of some plant cells. Conventional cassava roots lack some of the essential enzymes necessary to produce ß-carotene. The initial step in the pathway is controlled by deoxyxylulose-5-phosphate synthase (DXS), which is added to Cahoon’s cassava via the gene dxs , originally sourced from a different plant species. Additional steps generate the C5 isopentenyl diphosphate (IPP) that is used as the building block for the synthesis of the C20 geranylgeranyl diphosphate (GGDP). Phytoene synthase (PSY), the product of an introduced gene (psy) from a bacterial source, combines two molecules of GGDP to form phytoene, which is converted to ß-carotene via lycopene through a series of desaturation, isomerization, and cyclization reactions. The end result is a noticeably more orangey cassava root.

25 Arabidopsis gene, 1-deoxy-d-xylulose 5-phosphate synthase (dxs), which regulates the isoprenoid pathway, a set of biochemical reactions further upstream from the biosynthetic step in which psy is involved. Inserting dxs, which increases the amount of chemical precursors to beta-carotene, was “like turning up the whole isoprenoid pathway,” Cahoon says. He found that inserting both the psy and dxs genes resulted in a cassava even more orange than the roots with only the psy modification—and with 30 times more beta-carotene than normal roots. The BioCassava Plus program has also recently seen significant progress in its goal to introduce biofortified foods into the developing world. Director Richard Sayre says that the program’s pro-vitamin A cassava plants have been approved for field trials in Nigeria, the world’s number one consumer of the food. In July, the country planted between 4000 and 8000 m2 with Cahoon’s two-gene GM cassava, the first GM product Nigeria has field tested. “We are quite proud of that,” Sayre says. To advance the BioCassava Plus program to the next stage, Sayre says that more donor money will be needed. He says that the program is “planning on approaching other donors,” but declined to name them.

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35 Aqueous enzymatic treatment
Capsicum flour Capsaicinoids (26%) Carotenoids (70%) Residual flour 96% Ethanol extraction Capsaicinoids (62%) Carotenoids (1.4%) 30% Ethanol extraction Capsaicinoids (80%) Carotenoids (73%) Residual flour 96% Ethanol extraction Capsaicinoids (15%) Carotenoids (0%) Aqueous enzymatic treatment Capsaicinoids (44%) Carotenoids (2%) 30% Ethanol extraction 96% Ethanol extraction Capsaicinoids (27%) Carotenoids (83%) Residual flour

36 Capsaicinoides Capsaicina
Compuestos causantes de la pungencia en los chiles (Capsicum annuum). Estimulantes en el tracto digestivo, bloqueadores de la transmisión del dolor y promueven el metabolismo energético. Aplicaciones: Condimentos alimenticios, industria del tabaco, repelentes de protección personal y en compuestos para la agricultura, pinturas marinas, medicamentos contra el dolor. O H M e N C 3 Los capsaicinoides son los causantes de la pungencia o picante en los chiles y presentan varias propiedades como que son estimulantes en el tracto digetivo, bloquean la transmision del dolor y promueven el metabolismo energetico. Debdio a estas caracterirticas, tienen aplicaciones tanto en la industria alimentaria com en la farmaceutica . Una de las aplicaciones modernas es en medicamentos contra el dolor en padecimientos como la artritis cancer de boca. Sin embargo un efecto secundario que presentan es ardor en la piel. El mas importante y pungente de estos compuestos es la capsaicina. Esta molecula ha sido escogida como modelo de nuestro estudio por el interesante potencial de aplicacion de ella y de sus derivados sintetizados asi como de su caracteristica estructural de ser una amida grasa. Esta molecula se constituye de 3 partes principales, al anillo comun a todos los vainilloides, el enlace amida y la cadena hidrofobica. Capsaicina Santamaría R., Reyes Duarte M.D., Barzana E., Fernando D., Gama F.M., Mota M. & Lopez- Munguía A., Journal of Agricultural and Food Chemistry, 48, 7, , 2000.

37 Estructura de los capsaicinoides y su pungencia
Generalidades Estructura de los capsaicinoides y su pungencia Análisis sensorial medido en unidades Scoville Cuantificación en ppm por HPLC Modelo de Jancsó-Gabor Receptor de capsaicinoides (Caterina y col. Nature, 1997) Precisamente la pungencia de los capsacinoides esta directametne relacionada con su estructura. El método tradicional para medir la pungencia de los capsaicinoides, es a través de un análisis sensorial evaluado en una escala de unidades Scoville (Scoville, 1912) y se ha correlacionado con análisis realizados por (en cromatografía de gases (Todd,1977), tal vez podria montarse una tecnica por este metodo porque los esteres tienen un punto de fusion muy diferente al de las amidas y la separacion en CG podria correlacionarse con la pungencia y ) cromatografía de líquidos de alta resolución (Batchelor & Jones, 2000).Este ultimo método se basa en la longitud de lcadena hidrofóbica de los compuestos. Analizando el modelo de Szolcsanyi y Jancsó-Gabor para el estímulo de los receptores en los nervios sensitivos se puede observar que las 3 partes de la molecula (anillo vainilloide, enlace amida y cadena hidrofobica) interaccionan con el receptor. Esto indica que las metodologias como la del HPLC es limitante para cuantificar en pungencia los nuevos análogos modificados en otra parte de la molécula. El descubrimiento de que los capsaicinoides activan las fibras nerviosas sensoriales a través de canales iónicos como es el receptor vainilloide 1(VR1) (Caterina et al., 1997) o que tienen efecto en otro tipo de canales iónicos (Kuenzi & Dale, 1996) permitiría diseñar métodos mucho más sensibles y exactos para medir la pungencia así como el efecto de los capsaicinoides y sus derivados en el organismo. Al unirse la capsaicina al canal, éste se activa, abriéndose y permitiendo un flujo de entrada de iones calcio y sodio que depolarizan las fibras neuronales y mandan impulsos nerviosos a través de la columna vertebral hacia el cerebro. El resultado de este impulso es un aumento de temperatura y como consecuencia de esto, una desensibilización. Con estos antecedentes se podr[ia suponer que al modificar la molecula de capsaicina, podr[ia haber cambios en su pungencia.

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39 Conversión de capsaicina en agua utilizando diferentes enzimas
Resultados Conversión de capsaicina en agua utilizando diferentes enzimas Enzimas Conversión a (%) Lipasas (b) Novozym 677 BG 0.3 Lipasa F 1 Esterasa Diversa 001 8 Novozym 435 30 Proteasas (c) Tripsina 0.05 Penicilino acilasa 0.1 Conversión de hidrólisis de capsaicina en agua, cuantificando la vainillinamina producida después 24 h de reacción a (b) 45 ºC y (c) 37 ºC. Con ninguna de las enzimas probadas se observó reacción en el medio A (cloroformo-agua). En el medio B, la lipasa B de Candida antarctica (Novozym 435), fue la única que presentó hidrólisis, aunque sólo 15%. En la tabla 3, se observa el porcentaje de conversión de la reacción de hidrólisis catalizada por varias enzimas en el medio C (agua – capsaicina) después de 24 hrs.

40 Reacción de hidrólisis de la capsaicina
O H M e N C 3 2 + Capsaicina Vainillinamina Acido 8-metil-6-trans-nonanenoico Enzima hidrolítica Por otro lado les puedo decir que la idea inicial del proyecto surgió de estudiar si las lipasas, dentro de su amplio rango de sustratos podrían reconocer el enlace amido de la capsaicina[1] e hidrolizarlo, y así modificar su pungencia. Una vez comprobado esto, surgió el interés de analizar y contribuir al conocimiento sobre especificidad de las lipasas en la síntesis e hidrólisis de amidas, utilizando como modelo de estudio a la capsaicina debido a su importancia alimentaria y farmacéutica4. Reyes- Duarte D., Castillo E. Bárzana E. & López-Munguía A. Biotechnology Letters. 22 : ,

41 Síntesis de N-vainillíl oleamida : Efecto de la amina terciaria
H C O H C O 3 3 H C l + N N + H O N H H O N H H C l 2 2 V a i n i l l i n a m i n a D I P E A H C O 3 O A c i d o o l e i c o H O N L i p a s a B d e H Un aspecto que resulto muy importante en las reacciones de sintesis de vainillinoleamida fue la amna terciaria. Como mencione en un inicio, la vainillinamina comercialmente se encuentra en forma d clorhidrato para evitar su descomposicion ya que es muy reactiva y para liberar la sal hay que agregar una amina terciaria que secuestre al clorhidrato, libere la amina y se pueda llevar a cabo la reaccion con el acido oleico. Asi que descubrimos, mediante mediciones de velocidad inicial, que mientras mayor proporcion de DIPEA agregabamos, (1 a uno, 1 a 3, a 6 a 12 y a 18) mayor era la velocidad de reaccion, hasta llegar a un punto donde ya no hay tanta diferencia en el efecto. En ambos solventes, 2M2B y hexano, el comportamiento fue el mismo. Tambien es importante hacer notar que la vel. Inicial en 2M2B es de un orden de magnitud mayor que en hexano. Al llevar a cabo las reacciones de síntesis de vainillinoleamida con distintas concentraciones de amina terciaria, se observó un aumento en la velocidad inicial de reacción al aumentar la concentración de DIPEA (fig. 4). La amina terciaria no es reactiva pero su pare electronico libre secuestra el H del clorhidrato, desprotegiendo asi la amina de la vainillinamina. 4.- El efecto de concentracion de DIPEA en la reaccion es muy importante en la velocidad de reaccion de la enzima y en la conversion. Si analizamos sus velocidades iniciales encontramos que el efecto de la DIPEA es muy claro, la liberacion de la amina es paso limitante en la reaccion. Mientras mayor es la amina disponible, mayor la velocidad de reaccion. C a n d i d a a n t a r c t i c a N-Vainillíl oleamida (olvanil) Reyes D.D., Castillo E., Martinez R. & López Munguía A. Biotechnology Letters 24,

42 Síntesis enzimática de capsiato en un solo sistema
Alcohólisis Hidrólisis y síntesis Vainillinalcohol Lipasa B de Candida antarctica Capsaicina Los capsiatos son compuestos encontrados como los capsaicinoides, en los chiles. Estos compuestos son estructuralmente similares entre ellos, sólo que los capsaicinoides son amidas y los capsiatos son ésteres. Esta diferencia les confiere propiedades organolépticas muy distintas: los capsaicinoides son picantes, mientras los capsiatos no lo son. Sin embargo, ambos elevan la temperatura corporal y lo poco estudiado indica que presenta propiedades fisiologicas similares pero con menor estimulacion dolorosa. Esto les confiere un gran potencial en la medicina debido a que una limitante de utilizar la capsaicina es su alta pungencia. Hasta ahora, los capsiatos, además de ser obtenidos por extracción de los chiles dulces, son sintetizados realizando una hidrólisis química de la capsaicina, purificando el ácido graso y utilizándolo como sustrato para reacciones de síntesis enzimáticas47. La reacción propuesta en este proyecto para sintetizar capsiato es partiendo de la capsaicina en un solo proceso. Puede ser de síntesis directa como “transesteramidación” (esquema) o bien en presencia de agua como sustrato, como una hidrólisis seguida de una síntesis. En ambos casos la enzima cataliza las reacciones y sería en un solo proceso (one-pot). Capsiato Vainillinamina

43 Efecto de la capsaicina y sus derivados en el canal de calcio T de células espermatogénicas y la relación con su pungencia Posiblemente se podria encontrar una correlación entre pungencia y efecto de inhibicion en este canal de estas células, y podria dar paso a estudios posteriores con el receptor real de la capsaicina (el receptor vanilloide). En la figura A se observa la aplicación de pulsos de voltajes que van desde -90 a 80mV, observando la respuesta normal del canal de calcio (panel de arriba) y la respuesta al agregar una solución de capsaicina 50mM. Como se puede observar, la disminución de la respuesta es casi completa. Se analizó la vainillinamina (producto de hidrólisis de la capsaicina) y el capsiato, encontrando que este compuesto no tiene ningún efecto en la respuesta del canal de calcio (figura E). Sensorialmente, la capsaicina es pungente, su hidrolizado no, ni tampoco el capsiato.

44 Síntesis de Análogos de la Capsaicina
Síntesis de amidas con altos rendimientos (>80%) en 2M2B (solvente polar) independientemente de la estructura del análogo. 2 análogos con actividad pungente

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46 Análogos de capsaicina : inhibidores de canales Ca2+ T-type
Síntesis de Olvanil Síntesis de Capsiato

47 Evaluación farmacológica
(Colaboración con Alberto Darszon e Ignacio López) inhibidores de canales Ca2+ T-type

48 Síntesis quimoenzimatica del Fenil-acetil-rinvanil
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