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Aplicaciones de la PCR y otras técnicas de genética molecular en ganadería: enfermedades hereditarias y no hereditarias Inmaculada Martín Burriel

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Presentación del tema: "Aplicaciones de la PCR y otras técnicas de genética molecular en ganadería: enfermedades hereditarias y no hereditarias Inmaculada Martín Burriel"— Transcripción de la presentación:

1 Aplicaciones de la PCR y otras técnicas de genética molecular en ganadería: enfermedades hereditarias y no hereditarias Inmaculada Martín Burriel

2 Enfermedad genética Desviación del estado de salud debida total o parcialmente a la constitución genética del individuo, en el que factores ambientales pueden cumplir una función importante en la expresión y gravedad de los defectos o síntomas

3 ¿Cómo reconocerlas? Historia familiar – análisis de pedigríes: Especies: Perros, Caballos, Vacuno lechero Reconocimiento del modo de herencia Control de filiación

4 ¿Cómo reconocerlas? Epidemiología de la enfermedad Aparición de casos puntuales Aparición en estirpes Análisis de pedigríes Determinación del tipo de herencia

5 ¿Cómo reconocerlas? Examen físico: Buscar cambios estructurales, fenotipos característicos, alteraciones en las manos, pies, piel, pelo, etc.

6 ¿Cómo reconocerlas? Examen laboratorial: Estudios bioquímicos, inmunológicos, citogenéticos y de genética molecular.

7 Tipos de Herencia en Medicina Veterinaria Fenotipo (enfermedad) = genotipo + ambiente Factor genético 1.Enfermedades (o rasgos) monogénicas: Con herencia mendeliana más o menos regular Citrulinemia, BLAD, DUMPS,etc. 2.Enfermedades de herencia multifactorial 1.Poligénicas 2.Monogénicas con importante componente ambiental 3.Enfermedades de origen cromosómico (cromosomopatías) 1.Se detectan al microscopio 2.Se originan en la meiosis 3.No heredables o herencia irregular 4.Afectan a muchos genes cuadro grave, muchos letales

8 Caracteres Mendelianos Online Mendelian Inheritance in Animals: PerroVacaGatoCerdoCaballoOvejaPolloCabraConejo Fenotipos totales Monogénicos Caracterizados a nivel molecular Modelos humana Modelo en animales /01/09

9 Enfermedades en bovino CVM (malformación vertebral compleja) BLAD DUMPS HIPERTROFIA MUSCULAR hm MULEFOOT O SINDACTILISMO CITRULINEMIA

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19 VI JORNADAS PRODUCCION ANIMAL G G C C T C GA C C G G C C T C GG C C 7 bases 13 bases 7 bases 13 bases 30 bases 28 bases Hae III Taq I Hae III 19 bases 9 bases 49 bases 25 bases 33 bases 58 bases ( Taq I no encuentra secuencia de corte) Alelo MUTADO (D 128 G) Secuencia reconocida por Taq I Secuencia reconocida por Hae III Lugar de corte de Taq I Lugar de corte de Hae III Fragmento originado por digestión con Taq I Fragmento originado por digestión con Hae III Leyenda * La mutación se produce en la base 28 Alelo NORMAL(D 128)

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21 DIAGNOSTICO DE BLAD Diagnóstico: PCR + Taq I G/G D/G D/D

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24 DETECCIÓN DEL SINDROME DE ESTRÉS PORCINO (PSS) $

25 DETECCIÓN DEL SINDROME DE ESTRÉS PORCINO (PSS) MUTACIÓN EN EL GEN DE RYR-l Receptor de la ryanodina Cambio de C (alelo Normal) por T (alelo mutado) Herencia Autosomica recesiva

26 DETECCIÓN DEL SINDROME DE ESTRÉS PORCINO (PSS) DETECCIÓN POR LIGAMIENTO - Halotano - Polimorfísmos bioquímicos (Hb,PGD y GPI)

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28 DETECCIÓN DEL SINDROME DE ESTRÉS PORCINO (PSS) C 199bp PCR 199bp T 165bp 34bp BsiHKA I

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32 Factores genéticos de las EETs Introducción Implicaciones genéticas de las EETs Gen PRNP Genética de las EETs en humanos Genética de las EETs en ratón Genética de las EETs en especies de abasto: EETs en ovino (Scrapie) EETs en caprino y bovino

33 ENCEFALOPATÍAS ESPONGIFORMES TRANSMISIBLES ENFERMEDADES NEURODEGENERATIVAS - hereditaria - esporádica - infecciosa AnimalesHumanas Kuru Enfermedad de Creutzfeld-Jakob Insomnio Familiar Fatal Encefalopatía Espongiforme Bovina Enfermedad Transmisible del Visón SCRAPIE (Tembladera) ovino y caprino Susceptibilidad genética INTRODUCCIÓN

34 Encefalopatías Espongiformes Transmisibles CARACTERÍSTICAS HISTOPATOLÓGICAS COMUNES Depósitos de PrP Sc Pérdida neuronal y gliosis EspongiosisVacuolización

35 Encefalopatías Espongiformes Transmisibles Agente causal de tipo infeccioso PrP (Proteína Prión) PrP C PrP Sc Cambio de conformación Proteína sensible a proteasasProteína resistente a proteasas depósito en tejidos celulares Sistema linfoide SNC INTRODUCCIÓN

36 GEN PRNP (Proteína prión) Secuencia muy conservada en un gran número de especies ( aa) Alto grado de polimorfismo relacionado con SUSCEPTIBILIDAD Período de incubación (humano, ovino y caprino)

37 Factores genéticos de las EETs Introducción Implicaciones genéticas de las EETs Gen PRNP Genética de las EETs en humanos Genética de las EETs en ratón Genética de las EETs en especies de abasto: EETs en ovino (Scrapie) EETs en caprino y bovino

38 Implicaciones genéticas de las EETs NPU (1961): Selección intra-raza según la resistencia a la infección de scrapie experimental Interacción entre el genotipo del hospedador y las cepas de scrapie.

39 Implicaciones genéticas de las EETs Gen Sip (Scrapie incubation period): Gen mayor que controla la duración del periodo de incubación de scrapie. NPU: sA (p.i. corto) > pA (p.i. largo) Dickinson (1968): Gen sinc (Scrapie incubation): Estudios experimentales en ratones. Comportamiento dependiente de la cepa de scrapie (ME7 y 22A) s7 (p.i. corto) > p7 (p.i. largo)

40 Implicaciones genéticas de las EETs La proteína priónica PrP aparece en la fracción infecciosa de los homogeneizados de scrapie. Asociación genética entre el gen PRNP y la longitud del periodo de incubación de scrapie en ratón. Identificación de mutaciones del gen PRNP en ciertas patologías humanas En ovino el gen mayor Sip está estrechamente ligado a PRNP. Ratones knock-out para el gen PRNP son resistentes a la enfermedad Gen de la proteína prión (PRNP):

41 Factores genéticos de las EETs Implicaciones genéticas de las EETs Gen PRNP Genética de las EETs en humanos Genética de las EETs en ratón Genética de las EETs en especies de abasto: EETs en ovino (Scrapie) EETs en caprino y bovino

42 Gen PRNP Longitud kpb: 2 o 3 exones según la especie Región codificante (ORF) en un único exón (2kpb) Codifica una glicoproteína de membrana de entre 230 y 250 aa según la especie Altamente conservado entre especies.

43 Gen PRNP ORF3UTR Exon1Exon2Exon3 Proteína PrP murina Péptido señal Repet. octapéptidos SS Unión GPI CHO Proteína PrP humana 1245

44 Gen PRNP

45 Identificación y localización del gen PRNP

46 Gen PRNP Homología de secuencia Humano vs Bovino Humano vs Ovino Bovino vs Ovino 66.7 % 65.4 % 94.0 % Prusiner (1998)

47 Gen PRNP Mutaciones puntuales: Inserciones y delecciones de octapéptidos GTCGCCGTCGCCValAla PHGGGWGQ Polimorfismos

48 Gen PRNP Prusiner (1998) Polimorfismos

49 Factores genéticos de las EETs Implicaciones genéticas de las EETs Gen PRNP Genética de las EETs en humanos Genética de las EETs en ratón Genética de las EETs en especies de abasto: EETs en ovino (Scrapie) EETs en caprino y bovino

50 Genética de las EETs humanas Polimorfismo más importante: Codón 129 Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob Met/Met Val/Val Susceptibilidad

51 Genética de las EETs humanas Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob Mutación más común en el codón Sustitución de Lisina por Glutamina - 70% de familias Patologías distintas dependiendo de la combinación de mutaciones existente Familiar

52 Genética de las EETs humanas

53 Genética de las EETs humanas

54 Genética de las EETs humanas

55 Genética de las EETs humanas Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob Hipótesis muy probable: Se produce una mutación somática del gen PRNP en un número muy reducido de células. Esporádica

56 Factores genéticos de las EETs Introducción Implicaciones genéticas de las EETs Gen PRNP Genética de las EETs en humanos Genética de las EETs en ratón Genética de las EETs en especies de abasto: EETs en ovino (Scrapie) EETs en caprino y bovino

57 Genética de las EETs en ratón Polimorfismos genéticos del gen Prnp murino Polimorfismos en los codones 108 y 189 determinan diferencias en el periodo de incubación de scrapie. Utilizado como modelo para confirmar la importancia de las mutaciones detectadas en el gen PRNP humano. Identificación de QTLs ligados al periodo de incubación del la enfermedad.

58 Genética de las EETs en ratón Búsqueda de QTLs asociados a las EETs QTL: Quantitative Trait Loci Caracteres cuantitativos determinados por el efecto aditivo de la acción de varios genes. El periodo de incubación es un carácter cuantitativo El ratón como animal modelo: Razones económicas Control del manejo Disponibilidad de líneas consanguíneas con periodos de incubación muy distintos. Loyd et al. (2001)

59 Genética de las EETs en ratón Búsqueda de QTLs asociados a las EETs CAST/EiNZW/OlaHsdCAST/EiNZW/OlaHsd F1 F2 Loyd et al. (2001)

60 Genética de las EETs en ratón Análisis de la F2: Inoculación intracerebral con scrapie Determinación del periodo de incubación (1000 anim) Análisis de 150 microsatélites (marcadores altamente polimórficos dispersos por todo el genoma) Análisis de ligamiento entre el genotipo de los marcadores y el periodo de incubación. Chr. 2 Chr. 11 Chr. 12 Loyd et al. (2001) Otros QTLs: Chr. 9 y 11 (Stephenson et al., 2001) Existen otros genes relacionados con el periodo de incubación de la enfermedad

61 Factores genéticos de las EETs Introducción Implicaciones genéticas de las EETs Gen PRNP Genética de las EETs en humanos Genética de las EETs en ratón Genética de las EETs en especies de abasto: EETs en ovino (Scrapie) EETs en caprino y bovino

62 Genética de las EETs en ovino Gen PrP ovino Tamaño del gen 20kpb Proteína de 256 aa Homología con bovino (94%) Secuencia aminoacídica de la PrP bovina de la ovina en 7 u 8 posiciones Localización: 13 (13q17/18)

63 INTRODUCCIÓN GEN PRNP OVINO Más de 45 cambios aminoacídicos (Vaccari y cols., 2007) Codones SCRAPIE CLÁSICO Codón 141 SCRAPIE ATÍPICO (Nor98) 4 codones asociados a susceptibilidad En scrapie y EEB experimentales y ensayos in vitro: M137T, I142K, H143R, R151C, P168L, N176K (Goldmann y cols., 2006; Vaccari y cols., 2007; Bossers y cols., 2000) Efecto protector

64 Estudios de los diferentes codones según la raza Codón 136 VV136Susceptibilidad AV136Susceptibilidad AA136Susceptibilidad AA depende de la raza: Cheviot Ile de France Flemish Swifter Resistencia Swaledale Texel Lacaune Romanov Susceptibilidad Genética de las EETs en ovino

65 Estudios de los diferentes codones según la raza Codón 154 Codón 171 RR154No determinado RH154Cierta resistencia HH154Resistencia QQ171Resistencia QR171Resistencia RR171Resistencia 1 Suffolk en Japón

66 Genética de las EETs en ovino Definidos los codones se establecen las posibles variantes ARRAHQARHARQVRQARRAHQARHARQVRQ Cierta resistencia Cierta susceptibilidad Susceptibilidad

67 Según el genotipo del animal y su comportamiento frente a la enfermedad se definen 5 categorías de riesgo: R1: Riesgo muy bajo individual y de la progenie R2: Riesgo bajo individual y de la progenie R3: Riesgo bajo individual y progenie dependiente del otro parental R4: Scrapie ocasional y progenie con mayor riesgo que R5: El mayor riesgo a scrapie Genética de las EETs en ovino

68 Riesgo 4 ARQ/ARQ ARR/VRQ Riesgo 5 ARQ/VRQ VRQ/VRQ Riesgo 3ARR/ARQ Riesgo 1ARR/ARR Categoría de riesgoGenotipo Razas: Charolaise y Blue de Maine

69 Genética de las EETs en ovino Razas: Bluefaced y Leicester Riesgo 2 ARR/AHQ AHQ/AHQ Riesgo 4 ARR/ARQ ARQ/ARQ Riesgo 5ARQ/ARQ Riesgo 1ARR/ARR Categoría de riesgoGenotipo

70 Genética de las EETs en ovino ¿Qué sucede en nuestras razas? Comunidad Autónoma de Aragón ¿Qué sucede en los animales con scrapie pertenecientes a nuestras razas? ¿Qué sucede en otras razas Mediterráneas?

71 * Determinación del riesgo genético de las razas ovinas aragonesas: Rasa Aragonesa. Ojinegra. Cartera. Maellana. Ansotana. * Búsqueda de nuevos polimorfismos en el gen PRNP. Polimorfismo de PRNP en ovino aragonés Acín, Martín-Burriel et al. (2004) J Gen Virol

72 Material y Métodos - Razas estudiadas : Rasa Aragonesa. (4 Rebaños) Ojinegra. (4 Rebaños) Cartera. (2 Rebaños) Maellana. (2 Rebaños) Ansotana. (1 Rebaño) - De cada rebaño: Todos los machos reproductores y hasta 50 de hembras. - Extracción y purificación del DNA de sangre entera, usando el Kit de Amersham® GFX Genomic DNA blood Minikit. Acín, Martín-Burriel et al. (2004) J Gen Virol

73 - Condiciones de la PCR: Componentes de la reacción Volumen / Reacción (ml) Concentración final Tp10X 2,51X dNTPs 2,4 120 mM Cl 2 Mg 0,751,5mM Cebador-Fr 0,250,2mM Cebador-R 0,25 0,2 mM H 2 O hasta ºC 5min 72ºC 5min 94ºC 30sec TaºC 30sec 72ºC 1min (x40) Material y Métodos Acín, Martín-Burriel et al. (2004) J Gen Virol

74 * Codones 136 y 154 con BspHI. (ODoherty et al., 2000) * Codón 171 con BslI y AccI. (Yuzbasiyan-Gurkan et al., 1999) - PCR/RFLPs: - SECUENCIACIÓN: * Amplificación de toda la región codificante. - F: 5-ATGGTGAAAAGCCACATAGGCAGT-3 - R: 5-CTATCCTACTATGAGAAAAATGAG-3 * Purificación del producto PCR (NúcleoTraPCR, Marcherey-Nagel®) y secuenciación. Material y Métodos Acín, Martín-Burriel et al. (2004) J Gen Virol

75 Resultados 136 y PCR/RFLPs: AR AHVR 127 R Q/H PCR 171 R/Q H PCR PCR ARR/ARR ARR/AHQAHQ/AHQARR/ARQARQ/AHQ ARR/ARH AHQ/ARH ARQ/ARQ ARQ/ARH ARQ/VRQ Acín, Martín-Burriel et al. (2004) J Gen Virol

76 Resultados R1 R2 R3 R4 R5 AnsotanaCartera Maellana OjinegraRasa Aragonesa 44% 31% 15% 39% 47% 14% 6% 4% 26% 48% 26% 83% 12% 2.5% 72% 24% 2% Porcentaje de animales según su nivel de riesgo Susceptibilidad – + R. Aragonesa: 46 ARQ/ARQ 2 ARR/ARQ Acín et al. (2004) Vet Rec Scrapie Acín, Martín-Burriel et al. (2004) J Gen Virol

77 Resultados * Se detectó (Ojinegra) la variante rara (Lisina) en el codon 171. * Se detectaron polimorfismos en 14 codones. * Se detectaron nuevos polimorfismos en la especie ovina: 101 (Q R) 151 (R G) 151 (R H) 172 (Y D) 175 (Q E) - SECUENCIACIÓN: * Se ha confirmado la mayoría de los resultados de RFLPs. Codon 171 Acín, Martín-Burriel et al. (2004) J Gen Virol

78 Conclusiones * Las razas ovinas autóctonas analizadas se presentan como razas muy susceptibles al padecimiento de scrapie. * El gen PRNP presenta una gran variabilidad en el ovino autóctono. * La técnica de PCR/RFLPs presenta un riesgo de error en la lectura debido a la presencia de alelos raros. * La técnica de secuenciación evita los riesgos de falsas lecturas, permitiendo además detectar nuevos polimorfismos. Acín, Martín-Burriel et al. (2004) J Gen Virol

79 POLIMORFISMOS DEL GEN PRNP EN OVINO MARROQUÍ Serrano et al. (2007) Vet Rec

80 MATERIAL Y MÉTODOS OVINO MARROQUÍ: 154 animales Animales 89 Dman 43 Boujâad 22 Sardi Extracción de DNA de sangre entera Genomic Blood DNA Purification Kit (GE Healthcare) Amplificación por PCR Fragmento de 768 pb: región codificante de PRNP Polimorfismos de PRNP en ovino marroquí Serrano et al. (2007) Vet Rec

81 Componentes Concentración final Volumen (µl) Tampón 10X1X5 dNTPs (1,25mM)120µM4,8 Cl 2 Mg (50mM)1,5 Cebador-F (20mM) 5-GGCAGTTGGATCCTGGTTCTC-3 0,20,5 Cebador-R (20mM) 5-ACAGGAAGGTTGCCCCTATCC-3 0,20,5 DNA ng2 Taq polimerasa (5U/ml)0,05U/µl0,5 H 2 O milliQ hasta--50 PROTOCOLO de PCR Programa 94ºC 2min 94ºC 15seg 60ºC 15seg 72ºC 20seg 72ºC 5min x 30 ciclos Purificación del producto de PCR ExoSAP-IT (USB) SECUENCIACIÓN MATERIAL Y MÉTODOS Polimorfismos de PRNP en ovino marroquí Serrano et al. (2007) Vet Rec

82 Química: Kit Big Dye Terminator (ddNTPs fluorescentes) Optimización de la reacción de secuenciación Componentes Volumen / Reacción (ml) Mix (Big Dye)4 Producto PCR1 Cebador-F / R (3,2mM) 1 H 2 O milliQ4 TOTAL10 Programa 96ºC 1min 96ºC 10seg 50ºC 5seg 60ºC 4min x 25 ciclos Precipitación con Etanol/EDTA y desnaturalización ABI PRISM 3100 MATERIAL Y MÉTODOS Análisis estadístico (GENEPOP) : cálculo de frecuencias alélicas, haplotípicas y genotípicas Polimorfismos de PRNP en ovino marroquí Serrano et al. (2007) Vet Rec

83 Polimorfismos de PRNP en ovino marroquí Electroferogramas de los fragmentos DNA Análisis de las secuencias (Chromas, BioEdit) CGTCGTCATCAT ( His Arg) Raza Dman Codón 114 Codón 146 AAT AGT (Asn Ser) Raza Boujâad Nuevo 10 polimorfismos conocidos (112, 136, 141, 143, 154, 171, 172, 176, 231, 237) RESULTADOS silentes Serrano et al. (2007) Vet Rec

84 Polimorfismos de PRNP en ovino marroquí RESULTADOS Polimorfismos relacionados con susceptibilidad Frecuencias de haplotipo y genotipo / codones 136, 154, 171 ARQ ALTA SUSCEPTIBILIDAD ARR CIERTA RESISTENCIA ARQ/ARQ ARR/ARQ SUSCEPTIBILIDAD (razas mediterráneas) (Mutaciones en codón 171) Haplotípicas Genotípicas Serrano et al. (2007) Vet Rec BoujâadD'manSardi Frecuencia (%) ARQ ARR ARH BoujâadD'manSardi Frecuencia (%) ARQ/ARQ ARR/ARQ ARR/ARR ARH/ARQ

85 Polimorfismos de PRNP en ovino marroquí RESULTADOS Otros polimorfismos Frecuencias alélicas Total KAAA NAAC DGAT YTAT SAGT NAAT RCGT HCAT FTTT LCTT RCGT HCAT TACG MATG 112 SardiDmanBoujâad Amino ácido SecuenciaCodón NUEVO (Acín y cols., 2004) Nor98 Serrano et al. (2007) Vet Rec

86 HaplotiposSardiDmanBoujâad ARR ARH ARQ T 112 ARQ R 114 ARQ AF 141 RQ AR 143 RQ AS 146 RQ ARQD ARQK Total haplotipos (2 nuevos) 27 genotipos diferentes Polimorfismos de PRNP en ovino marroquí RESULTADOS Frecuencias haplotípicas Serrano et al. (2007) Vet Rec

87 Primer análisis del gen PRNP en poblaciones ovinas africanas Gran variabilidad genética Susceptibilidad a scrapie clásico y atípico, a pesar de ausencia de casos de scrapie (= Australia y Nueva Zelanda) Las mutaciones detectadas aparecen también en otras razas mediterráneas, posiblemente debido a la influencia de las migraciones desde el continente africano Polimorfismos de PRNP en ovino marroquí RESULTADOS Y DISCUSIÓN Serrano et al. (2007) Vet Rec

88 Factores genéticos de las EETs Introducción Implicaciones genéticas de las EETs Gen PRNP Genética de las EETs en humanos Genética de las EETs en ratón Genética de las EETs en especies de abasto: EETs en ovino (Scrapie) EETs en caprino y bovino

89 GEN PRNP CAPRINO INTRODUCCIÓN 24 cambios aminoacídicos descritos en la región codificante (Acutis y cols., 2008) 6 codones asociados con susceptibilidad a scrapie: I142M H154R W102G + 3 repeticiones de octapéptidos Período de incubación (Goldmann y cols., 1996; Billinis y cols., 2002; Vaccari y cols., 2006) Resistencia (Billinis y cols., 2002; Papasavva-Stylianou y cols., 2007; Vaccari y cols., 2006) H143R N146S y N146D Q222K Mutación más frecuente: S240P (TCC CCC)

90 POLIMORFISMOS DEL GEN PRNP EN POBLACIONES CAPRINAS MARROQUÍES Serrano et al. (en prensa) An Genet

91 CAPRINO MARROQUÍ: 137 animales MATERIAL Y MÉTODOS Polimorfismos de PRNP en caprino marroquí 80 Dman 57 Chaouni Animales Identificación de polimorfismos: Secuenciación (= ESTUDIO 1) Análisis estadístico: GENEPOP ARLEQUIN (estimación de frecuencias haplotípicas) Determinación y diferenciación de haplotipos: PCR alelo-específica Secuenciación Serrano et al. (en prensa) An Genet

92 Polimorfismos de PRNP en caprino marroquí RESULTADOS Análisis de electroferogramas (BioEdit) 3 NUEVAS MUTACIONES AGCAGG ( Arg Ser) Dman Codón 139 Codón 145 GGC GAC (Gly Asp) Chaouni y Dman CGGCGGCAGCAG ( Gln Arg) Dman Codón polimorfismos conocidos Serrano et al. (en prensa) An Genet

93 Polimorfismos de PRNP en caprino marroquí RESULTADOS Nuevas mutaciones CodónSecuencia Amino ácido ChaouniDman 101 CAGQ CGGR AGGR AGCS GGCG GACD Total 5780 Frecuencias alélicas Frecuencias bajas (< 2 %) Serrano et al. (en prensa) An Genet

94 Polimorfismos de PRNP en caprino marroquí RESULTADOS Polimorfismos conocidos CodónSecuencia Amino ácido ChaouniDman 37 GGGG93100 GTGV GGCG AGCS ATGM ATAI ATAI ATGM CGTR CATH CAGQ AAGK TCCS CCCP Total 5780 Frecuencias alélicas CIERTA RESISTENCIA FRECUENCIAS INTERMEDIAS Serrano et al. (en prensa) An Genet

95 Polimorfismos de PRNP en caprino marroquí RESULTADOS Mutaciones silentes: Codón 181: GAC GAT (Asp) (1.8% en raza Dman) Codón 42: Codón 138: CCA CCG (Pro) AGC AGT (Ser) LIGADOS AL DIMORFISMO S240P (TCC CCC) (Goldmann y cols., 1996; Kurosaki y cols., 2005; Acutis y cols., 2006; Babar y cols, 2007) Serrano et al. (en prensa) An Genet

96 CC AG Codón 42 Codón 240 Codón 138 CCA TCC CA/GG AGC AGG/C GG/ACCG/AT Codón 101 Codón 101 Codón 139 Codón 139 Codón 145 Codón 145 Codón 154 Codón 154 GGT (PrP) Rev PCR alelo-específica Polimorfismos de PRNP en caprino marroquí PP 240 PS 240 SS 240 Secuenciación (cebador específico- S 240 ) Heterocigotos Serrano et al. (en prensa) An Genet

97 Polimorfismos de PRNP en caprino marroquí RESULTADOS Determinación de haplotipos PCR alelo-específica S 240 P 240 Haplo ChaouniDman 1 GQGMRIGRQS GQGMRIGRQP VQGMRIGRQS 70 4 GRGMRIGRQP GQSMRIGRQP GQGIRIGRQP GQGMSIGRQP GQGMRMGRQP GQGMRIDRQS GQGMRIGHQS GQGMRIGHQP GQGMRIGRKS Frecuencias haplotípicas 17 Estimados (ARLEQUIN) 10 Chaouni 13 Dman 12 haplotipos (3 nuevos) 28 genotipos diferentes (4 no reales) Serrano et al. (en prensa) An Genet

98 Primer análisis de PRNP en poblaciones caprinas africanas Gran variabilidad genética Cierta resistencia a scrapie (H 154 ) Proximidad genética con razas caprinas mediterráneas de Italia y Grecia Polimorfismos de PRNP en caprino marroquí RESULTADOS Y DISCUSIÓN Serrano et al. (en prensa) An Genet

99 Genética de las EETs en bovino Secuencia aminoacídica de la PrP bovina de la ovina en 7 u 8 posiciones. Polimorfismos: 22 mutaciones silentes 12 cambios aminoacídicos Repeticiones de octapéptidos 5 copias (5/5). 6 copias (6/6). El más común 5 y 6 copias (5/6) (Heterocigoto). Gen PrP bovino Sin relación con la susceptibilidad a BSE

100 Genética de las EETs en bovino Posible control genético: Formas clásicas de BSE: cambios en la expresión de PrPC: 23 bp del en la región promotora elimina un sitio de unión de RP58 12 bp del en intrón 1 elimina el sitio SP1 de unión de FT. Forma atípica: USA 2006: E211K: análogo al humano E200K responsable de TSE hereditaria ¿Otros genes? Posibles QTLs en BTA5, 10 y 20 (Hernández-Sánchez et al. 2002); BTA17, X/YPS y posibles en BTA1, 6, 13 y 19 (Zhang et al., 2004).

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102 ENFERMEDADES ENDEMICAS SALUD Impacto económico y social Diagnóstico precoz SALUD Impacto económico y social Diagnóstico precoz PROTOZOOS del género Leishmania Enfermedad que afecta al hombre y perro ZOONOSIS ENDEMICA EN ARAGON (OMS indicadora de SIDA) Riesgo calidad de vida - Salud Morbilidad y mortalidad

103 LEISHMANIOSIS Presencia de factores ecológicos: VECTORES RESERVORIOS ANIMALES COMO EL PERRO Presencia de factores ecológicos: VECTORES RESERVORIOS ANIMALES COMO EL PERRO TECNICAS CLASICAS Observación microscópica en ganglio o médula Métodos serológicos:IFI NUEVAS TECNICAS Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) Diagnóstico problemático

104 PCR SENSIBLE ESPECIFICA ECONOMICO EFICAZ Cebadores - Zona del genoma del parásito de varias copias Kinetoplastos: Pequeños círculos de DNA con genes repetidos SSUrRNA 18SrRNA Zonas bien conocidas en más de 100 especies: Leishmania infantum, Trypañosoma brucei, Trypanosoma cruzi,...

105 Comparar-Zona candidata Secuencias hospedador: humano y perro Secuenias del vector: artrópodo Secuencias del Kinetoplasto: parásito Diagnóstico directo del agente etiológico: Diferenciar portadores, enfermos y sanos PCR

106 Ampliación del DNA 94ºC --- 5' 94ºC --- 1' 60ºC --- 1' 72ºC --- 1' 72ºC ---10' 4ºC --- hasta recoger muestra Termociclador 9600 Perkin Elmer 35 ciclos muestra 15 l.

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108 DIAGNÓSTICO DE LEISHMANIA Amplificación del gen SSU rRNA repetido mas de 100 veces Muestra: Médula ósea, Ganglio linfático y Sangre


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