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EQUIPO UTILIZADO EN HISTOLOGIA. Técnicas Histológicas.

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1 EQUIPO UTILIZADO EN HISTOLOGIA

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3 Técnicas Histológicas

4 EQUIPO UTILIZADO EN HISTOLOGIA INTRODUCCION AL ESTUDIO DE LA HISTOLOGIA HISTOLOGIA estudio del tejido HISTOLOGIA estudio del tejido Es la rama de la Anatomía que estudia los tejidos de los Animales y las Plantas ANATOMIA MICROSCOPICA

5 EQUIPO UTILIZADO EN HISTOLOGIA PROCEDIMIENTOS INMEDIATO O VITALES MEDIATO O POSVITALES

6 EQUIPO UTILIZADO EN HISTOLOGIA ES EL CONJUNTO DE PROCEDIMIENTOS ES EL CONJUNTO DE PROCEDIMIENTOS REALIZADOS PARA OBTENER UN REALIZADOS PARA OBTENER UN PREPARADO HISTOLOGICO PREPARADO HISTOLOGICO TECNICA HISTOLOGICA

7 EQUIPO UTILIZADO EN HISTOLOGIA CÉLULAS, CÉLULAS, TEJIDOS Y TEJIDOS Y ORGANOS ORGANOS CELULAR: se alteran las membranas, lo que produce que los elementos internos difundan hacia el exterior. QUÍMICO: desciende el pH y se activan los sistemas hidrolíticos que provocan alteraciones marcadas en los tejidos. SU FINALIDAD ES PREPARAR: conociendo la anatomía, debemos dirigirnos directamente a los órganos que nos interesan estudiar. En el caso de que estos sean varios, es conveniente extraer primero los que más fácilmente se descomponen, estos son el páncreas y la porción inferior del tubo digestivo.

8 EQUIPO UTILIZADO EN HISTOLOGIA PREPARADO HISTOLOGICO: PREPARADO HISTOLOGICO: Es una rebanada de tejido colocada sobre una lámina portaobjetos, coloreada y cubierta por una lámina cubre-objetos. TECNICA HISTOLOGICA

9 EQUIPO UTILIZADO EN HISTOLOGIA ETAPAS DE LA TECNICA HISTOLOGICA ETAPAS DE LA TECNICA HISTOLOGICA 1. OBTENCION DEL MATERIAL OBTENCION DEL MATERIALOBTENCION DEL MATERIAL 2. FIJACION FIJACION 3. OBTENCION DEL BLOQUE DE PARAFINA OBTENCION DEL BLOQUE DE PARAFINAOBTENCION DEL BLOQUE DE PARAFINA 4. CORTE CORTE 5. COLORACION COLORACION 6. MONTAJE MONTAJE TECNICA HISTOLOGICA

10 EQUIPO UTILIZADO EN HISTOLOGIA PROBLEMAS DE INTERPRETACION al visualizar los cortes con el Microscopio TECNICA HISTOLOGICA A.- ARTEFACTOS: Cambios estructurales inducidos por las técnicas histológicas. B.- CONCEPTUALES

11 EQUIPO UTILIZADO EN HISTOLOGIA PROBLEMAS DE INTERPRETACION TECNICA HISTOLOGICA A.- ARTEFACTOS: DE FIJACION Precipitación de las proteínas. DE DESHIDRATACION Y ACLARAMIENTO Espacios opticamente vacíos DE LOS CORTES cortes de diferente grosor DEL MONTAJE pliegues DEGENERACION POSTMORTEN FINAL

12 EQUIPO UTILIZADO EN HISTOLOGIA

13 GRACIAS

14 TOMA DE MUESTRAS TECNICA HISTOLOGICA HISTOLOGIATEJIDOS NORMALES ANATOMIA PATOLOGICA TEJ. PATOLOGICOS Las muestras pueden ser obtenidas por:- Frotis. Frotis. Aspiración y/o lavado Aspiración y/o lavado punción aspiración con aguja fina punción aspiración con aguja fina impronta impronta biopsia biopsia punción con trocar, o autopsia. punción con trocar, o autopsia.

15 EQUIPO UTILIZADO EN HISTOLOGIA SI LA MUESTRA DE TEJIDO NO SE FIJA SE FIJA AUTOLISIS CONSERVA LAS CARACTERISTICAS TECNICA HISTOLOGICA

16 EQUIPO UTILIZADO EN HISTOLOGIA 2. FIJACION: AUTOLISIS Es la fase en la cual se preserva la morfología y la composición química de los tejidos evitando la AUTOLISIS TECNICA HISTOLOGICA

17 EQUIPO UTILIZADO EN HISTOLOGIA Preservar el tejido No producir artificios No dificultar el tratamiento ulterior Poder y velocidad de penetración CONDICIONES DE UN BUEN FIJADOR: CONDICIONES DE UN BUEN FIJADOR: SOLUCION AL 40% DE ALDEHIDO FORMICO FORMOL AL 10% USO TECNICA HISTOLOGICA

18 EQUIPO UTILIZADO EN HISTOLOGIA Para la FIJACIÓN DE PROTEINAS es necesario evitar su hidrólisis, bloqueando los lugares susceptibles de hidrólisis mediante: - Reticularización o desnaturalización, creando redes estables empleando aldehidos como formaldehido,ver actuación del formol, que se usa en solución acuosa al 2 % (formalina) para microscopía óptica, y glutaraldehido que se emplea al 2% en tampón, para microscopia electrónica. - Formación de sales insolubles, mediante productos como el. acido picrico empleado en la confección del fijador de Bouin. El cloruro de mercurio (muy tóxico) y el dicromáto potásico. - Cambios en el estado coloidal, mediante el calor (no recomendable). - Modificación del punto isoeléctrico, con ácido acético. formaldehidoactuación del formolglutaraldehido acido picricofijador de Bouinformaldehidoactuación del formolglutaraldehido acido picricofijador de Bouin

19 EQUIPO UTILIZADO EN HISTOLOGIA Para la FIJACIÓN DE LOS HIDRATOS DE CARBONO es necesario evitar que se disuelvan en agua, para ello hay que extraer el agua mediante fijadores cuya avided por el agua sea mayor que ellos, asi se emplea alcohol etilico (alcohol etílico al 70% en agua), y acetona. Tienen el inconveniente que retraen los tejido y los endurecen para el procesamiento posterior. Para la FIJACIÓN DE LOS HIDRATOS DE CARBONO es necesario evitar que se disuelvan en agua, para ello hay que extraer el agua mediante fijadores cuya avided por el agua sea mayor que ellos, asi se emplea alcohol etilico (alcohol etílico al 70% en agua), y acetona. Tienen el inconveniente que retraen los tejido y los endurecen para el procesamiento posterior. Para la FIJACIÓN DE LOS LIPIDOS es necesario evitar su oxidación o enranciamiento bloqueando los lugares donde existen enlaces - CH=CH - mediante sutancias como tetróxido de osmio (acido osmico),ver actuación del osmio, es el fijador ideal para microscopía electrónica, pues se fija en los dobles enlaces de las cadenas laterales de los lípidos de las membranas plasmáticas, y además el Os es un metal opaco a los electrones (sirve de tinción). Para la FIJACIÓN DE LOS LIPIDOS es necesario evitar su oxidación o enranciamiento bloqueando los lugares donde existen enlaces - CH=CH - mediante sutancias como tetróxido de osmio (acido osmico),ver actuación del osmio, es el fijador ideal para microscopía electrónica, pues se fija en los dobles enlaces de las cadenas laterales de los lípidos de las membranas plasmáticas, y además el Os es un metal opaco a los electrones (sirve de tinción).tetróxido de osmioactuación del osmiotetróxido de osmioactuación del osmio

20 EQUIPO UTILIZADO EN HISTOLOGIA 3. OBTENCION DEL BLOQUE DE PARAFINA DESHIDRATACION ACLARAMIENTO IMPREGNACION INCLUSION EN PARAFINA TECNICA HISTOLOGICA

21 EQUIPO UTILIZADO EN HISTOLOGIA 3.OBTENCION DEL BLOQUE DE PARAFINA TEJIDOS (Ricos en agua) TEJIDOS RICOS EN ALCOHOL DESHIDRATACION TEJIDOS RICOS EN XILOL ACLARAMIENTO IMPREGNACION EN PARAFINA TECNICA HISTOLOGICA

22 EQUIPO UTILIZADO EN HISTOLOGIA Luego de la Impregnación se Incluye en parafina, en pequeños cubos que forman el BLOQUE DE PARAFINA TECNICA HISTOLOGICA

23 EQUIPO UTILIZADO EN HISTOLOGIA TECNICA DE CORTE. - La obtención de rebanadas (cortes) de cuerpos sólidos, tiene por objeto el observar secciones translucidas de sus estructuras inernas. Los cortes demasiado gruesos permiten observar mas estructuras, pero con menos definición pues se superponen unas a otras. Los cortes finos pèrmiten ver menos estructura, pero con mas definición y finura. - La obtención de rebanadas (cortes) de cuerpos sólidos, tiene por objeto el observar secciones translucidas de sus estructuras inernas. Los cortes demasiado gruesos permiten observar mas estructuras, pero con menos definición pues se superponen unas a otras. Los cortes finos pèrmiten ver menos estructura, pero con mas definición y finura. - Para obtener cortes del cuerpo solido, se necesita que este posea un grado de dureza minimo, y proporcional a la finura de la rebanada que deseemos obtener: mas duro = mas fino. - Como la mayoría de los tejidos corporales son blandos, es necesario endurecerlos mediante las siguientes estrategias: - Para obtener cortes del cuerpo solido, se necesita que este posea un grado de dureza minimo, y proporcional a la finura de la rebanada que deseemos obtener: mas duro = mas fino. - Como la mayoría de los tejidos corporales son blandos, es necesario endurecerlos mediante las siguientes estrategias:

24 EQUIPO UTILIZADO EN HISTOLOGIA 1ª- Fijación en glutaraldehido: Ideal para cortes gruesos a mano alzada, mediante el microtomo de mano y navaja barbera (0,5- 3 mm de grosor), o mediante vibratomo.(0,5- 1 mm de grosor). 1ª- Fijación en glutaraldehido: Ideal para cortes gruesos a mano alzada, mediante el microtomo de mano y navaja barbera (0,5- 3 mm de grosor), o mediante vibratomo.(0,5- 1 mm de grosor). 2ª- Congelación en microtomo: -2 a -5 ºC. Ideal para hacer preparaciones rápidas, p.e. peroperatorias en antequirógfano.( micras de grosor) 2ª- Congelación en microtomo: -2 a -5 ºC. Ideal para hacer preparaciones rápidas, p.e. peroperatorias en antequirógfano.( micras de grosor) 3ª- Congelación en criostato: -15 a -30 ºC. Ideal para cortes finos en histoquímica.(5-20 micras de grosor) 3ª- Congelación en criostato: -15 a -30 ºC. Ideal para cortes finos en histoquímica.(5-20 micras de grosor)

25 EQUIPO UTILIZADO EN HISTOLOGIA 4ª- Inclusión en Parafina: Ideal para trabajo de cortes en serie y de alta estabilidad. Rutina de laboratorio.(5-20 micras). Los cortes se realizan en un aparato llamado microtomo de parafina (imagen derecha), La la pieza, en amarillo, se coloca en un brazo que se desliza verticalmente sobre una cuchilla, en azul, recubierta por un antirroll (antienrrollamiento) en azul mas claro. 4ª- Inclusión en Parafina: Ideal para trabajo de cortes en serie y de alta estabilidad. Rutina de laboratorio.(5-20 micras). Los cortes se realizan en un aparato llamado microtomo de parafina (imagen derecha), La la pieza, en amarillo, se coloca en un brazo que se desliza verticalmente sobre una cuchilla, en azul, recubierta por un antirroll (antienrrollamiento) en azul mas claro. 5ª- Inclusión en celoidina: Ideal para grandes piezas: p.e. Pulmon entero. Cerebro entero, etc.( micras) 5ª- Inclusión en celoidina: Ideal para grandes piezas: p.e. Pulmon entero. Cerebro entero, etc.( micras) 6ª- Inclusión en resinas epoxi: araldit, vestopal, etc Ideal para microscopía electerónica (20-40 nm) y corte de objetos extremadamente duros: hueso y diente. Se corta en el ultramicrotomo.mediante cuchillas de vidrio odiamante.. 6ª- Inclusión en resinas epoxi: araldit, vestopal, etc Ideal para microscopía electerónica (20-40 nm) y corte de objetos extremadamente duros: hueso y diente. Se corta en el ultramicrotomo.mediante cuchillas de vidrio odiamante..

26 EQUIPO UTILIZADO EN HISTOLOGIA 4.EL CORTE A.- Se corta en el microtomo C.- Se monta el corte en la lámina Portaobjetos B.- Se coloca en el Baño de María EJEMPLOS

27 EQUIPO UTILIZADO EN HISTOLOGIA 5.COLORACION: COLORANTE ES UNA SUSTANCIA CAPAZ DE COMUNICAR SU COLORACION A OTROS CUERPOS HEMATOXILINA - EOSINA TECNICA HISTOLOGICA La coloración más usada es

28 EQUIPO UTILIZADO EN HISTOLOGIA BATERIA DE COLORACION TECNICA HISTOLOGICA

29 EQUIPO UTILIZADO EN HISTOLOGIA 5.COLORACION TECNICA HISTOLOGICA EOSINA EOSINA Colorante ACIDO, tiñe de Rosado o Rojo elementos básicos Ej. Citoplasma HEMATOXILINA Colorante BÁSICO tiñe de Azul o púrpura, elementos ácidos Ej. El Núcleo

30 EQUIPO UTILIZADO EN HISTOLOGIA PASOS DE LA COLORACION DESPARAFINAR DESPARAFINAR REHIDRATAR REHIDRATAR HEMATOXILINA HEMATOXILINA DIFERENCIAR DIFERENCIAR EOSINA EOSINA ALCOHOL ALCOHOL XILOL XILOL TECNICA HISTOLOGICA

31 EQUIPO UTILIZADO EN HISTOLOGIA TECNICA DEL PAS ( Peryodic Acid Schiff) Para detectar enlaces 1-2 glicol (mucopolisacaridos) Y AZUL ALCIAN (mucopolisacaridos ácidos). -Ver actuacion del PAS.- TECNICA DEL PAS ( Peryodic Acid Schiff) Para detectar enlaces 1-2 glicol (mucopolisacaridos) Y AZUL ALCIAN (mucopolisacaridos ácidos). -Ver actuacion del PAS.-Ver actuacion del PASVer actuacion del PAS 1º.- Desparafinar e hidratar los cortes. 1º.- Desparafinar e hidratar los cortes. 2º.- Solución de azul alcian min. 2º.- Solución de azul alcian min.Solución de azul alcianSolución de azul alcian 3º.- Lavar en Agua destilada. 3º.- Lavar en Agua destilada. 4º.- Sol. de ácido peryódico min 4º.- Sol. de ácido peryódico minSol. de ácido peryódicoSol. de ácido peryódico 5º.- Lavado con Agua destilada. 5º.- Lavado con Agua destilada. 6º.- Solución dc Schiff min 6º.- Solución dc Schiff minSolución dc SchiffSolución dc Schiff 7º.- Lavado con agua sulfurosa 1 mm., agua destilada- 1 mm. y repetir varias veces. 7º.- Lavado con agua sulfurosa 1 mm., agua destilada- 1 mm. y repetir varias veces.agua sulfurosaagua sulfurosa 8º.- Lavar con agua corriente hasta que tome color rojo min. 8º.- Lavar con agua corriente hasta que tome color rojo min. 9º.- Teñir con Hernatoxilina (contraste de núcleos) min. 9º.- Teñir con Hernatoxilina (contraste de núcleos) min. 10º.- Lavar, deshidratar, aclarar y montar. 10º.- Lavar, deshidratar, aclarar y montar.

32 EQUIPO UTILIZADO EN HISTOLOGIA El acido peryódico (I04H) reaciona con los enlaces 1-2 glicol (-CHOH-OHHC-) transformándolos en aldehídos (-COH HOC-) donde se fija el reactivo se Schiff F(SO3H)2 El ácido peryódico no actúa cuando los grupos glicol están bloqueados por radicales ácidos Solución de azul alcian:Azul alcian gr. Acido acético c.c Agua destilada c.c Solución de Acido IO4H gr. Agua destilada ml. Solución de Schiff: Hervir 100 c.c. de agua destilada, apartarla del fuego y añadir 1 gr. de fucsina básica. A los 5 mm. añadir 1,5 gr. de metabisulfito sódico potásico Na2O3S2 y 3 c.c. de CIH normal, tapar el recipiente y dejar reposar durante 24 horas. en oscuridad. Depurar con carbón y filtrar. Si toma color paja, tira.r Agua sulfurosa: Metabisulfito sódico, SO3HNa, ----0,5 gr. AD ml. CIH gotas

33 EQUIPO UTILIZADO EN HISTOLOGIA CORTES HISTOLOGICOS HEMATOXILINA-EOSINA

34 EQUIPO UTILIZADO EN HISTOLOGIA Hematoxilina y Eosina. 1º.- Las láminas ya hidratadas se cubren con la Solución de hematoxilina durante 5 minutos. 2º.- Se lavan varias veces con agua durante un total de 15 minutos como mínimo. 3º.- Se cubren con la Solución de eosina durante 5 mm. 4º.- Lavar rápidamente. 5º.- Deshidratar con alcoholes de concentraciones crecientes 70%, 90%, 100% (deshidratar). 6º.- Aclarar en xilol y montar cl cubre con bálsamo del Canadá (aclarar y montar). 1º.- Las láminas ya hidratadas se cubren con la Solución de hematoxilina durante 5 minutos. 2º.- Se lavan varias veces con agua durante un total de 15 minutos como mínimo. 3º.- Se cubren con la Solución de eosina durante 5 mm. 4º.- Lavar rápidamente. 5º.- Deshidratar con alcoholes de concentraciones crecientes 70%, 90%, 100% (deshidratar). 6º.- Aclarar en xilol y montar cl cubre con bálsamo del Canadá (aclarar y montar).RESULTADOS La cromatina nuclear y compuestos basófilos aparecen en azul por la hematoxilina. El citoplasma, colágeno y compuestos acidófilos se tiñen en rosa o rojo por la eosina.

35 EQUIPO UTILIZADO EN HISTOLOGIA CORTES HISTOLOGICOS SUDAN Tejido adiposo con distintas coloraciones

36 EQUIPO UTILIZADO EN HISTOLOGIA SUDAN ROJO PARA TEÑIR LIPIDOS SIMPLES. 1º.- Cortes obtenidos por congelación (La inclusión en parafina disuelve las grasas). 1º.- Cortes obtenidos por congelación (La inclusión en parafina disuelve las grasas). 2º.- Introducir los cortes en la mezcla a partes iguales de Sudan III (saturación en Alcohol de 70º.) y Rojo Escarlata (saturación en alcohol de 70º.) (filtrado). 24 horas. 2º.- Introducir los cortes en la mezcla a partes iguales de Sudan III (saturación en Alcohol de 70º.) y Rojo Escarlata (saturación en alcohol de 70º.) (filtrado). 24 horas. 3º.- Lavar en agua destilada. 3º.- Lavar en agua destilada. 4º.- Teñir los nucleos con Hematoxilina de Groat--2 minutos. 4º.- Teñir los nucleos con Hematoxilina de Groat--2 minutos. 5º.- Lavar y secar con papel de filtro. 5º.- Lavar y secar con papel de filtro. 6º.- Montar en Plasdona. 6º.- Montar en Plasdona. Hematoxilina de Groat Una parte de: Acido sulfurico concentrado ml. Alunbre Férrico gr. Agua destilada ml. Dos partes de: Hematoxilina--0.5gr. Alcoholde 95º- 50ml

37 EQUIPO UTILIZADO EN HISTOLOGIA COLORACIONES ESPECIALES IMPREGNACION ARGENTICA

38 EQUIPO UTILIZADO EN HISTOLOGIA COLORACIONES ESPECIALES GIEMSA AZAN MODIFICADO

39 EQUIPO UTILIZADO EN HISTOLOGIA 6. MONTAJE TECNICA HISTOLOGICA Con un pegamento especial se coloca el Cubreobjeto sobre el tejido que se encuentra en el portaobjeto

40 EQUIPO UTILIZADO EN HISTOLOGIA Finalmente, cubrimos los "portas" con una delgada lámina de vidrio (cubreobjetos) en la cual colocamos una gota de medio adhesivo.

41 EQUIPO UTILIZADO EN HISTOLOGIA La parafina se coloca en una estufa a 70º C, con lo que se licua, introduciendo en ella la pieza que ha permanecido en benzol. Se deja toda la noche en la parafina A la mañana siguiente sacando la pieza de la estufa con parafina líquida y se confecciona el bloque, dejándole solidificar a temperatura ambiente

42 EQUIPO UTILIZADO EN HISTOLOGIA Una vez que el bloque se ha endurecido se adhiere sobre un taco de madera, por medio de espátula caliente

43 EQUIPO UTILIZADO EN HISTOLOGIA MICRÓTOMO El bloque endurecido se instala en el micrótomo de parafina, procediéndose al corte (Fig. N° 5).

44 EQUIPO UTILIZADO EN HISTOLOGIA Los cortes obtenidos, se extienden con ayuda de un pincel sobre el agua de un baño con agua caliente, pescándolo sobre un porta que se introduce por debajo

45 EQUIPO UTILIZADO EN HISTOLOGIA Una vez que han sido extraídos del baño María, se proceden a montar en el portaobjetos.

46 EQUIPO UTILIZADO EN HISTOLOGIA Los portas con los cortes se introducen inclinados en la estufa de 70º C para que se licue la parafina sobrante y escurra. Se introducen en un recipiente con xilol para que la parafina se disuelva. El corte libre de parafina es necesario hidratarlo para que se pueda proceder a su coloración. La hidratación sigue un proceso inverso a la deshidratación. Se pasa por alcoholes de concentraciones decrecientes, terminando en agua igual que en el proceso de corte por congelación

47 EQUIPO UTILIZADO EN HISTOLOGIA ACTUACION

48 EQUIPO UTILIZADO EN HISTOLOGIA

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50 Fijador de Bouin Aciclo pícrico a saturación ml.. Acetato de cobre gr. Formalina (formol comercial al 10%---- l00 c.c

51 EQUIPO UTILIZADO EN HISTOLOGIA ACTUACION


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