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TOXICOS VOLÁTILES EN TOXICOLOGÍA FORENSE LUIS ALBERTO FERRARI Doctor Químico y Lic. En Ciencias Farmacéuticas Perito Químico Judicial y Profesor Titular.

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1 TOXICOS VOLÁTILES EN TOXICOLOGÍA FORENSE LUIS ALBERTO FERRARI Doctor Químico y Lic. En Ciencias Farmacéuticas Perito Químico Judicial y Profesor Titular de Toxicología y Química Forense-U.M. Representante Regional de TIAFT

2 Tóxicos volátiles relevantes: *Gases letales: CO y HCN *Alcoholes: etílico, metílico y glicoles.

3 FACTORES FISICOS Y QUÍMICOS INVOLUCRADOS EN LA GENERACIÓN DE ACIDO CIANHÍDRICO Y MONÓXIDO DE CARBONO EN INCENDIOS. TRATAMIENTO DE LOS DATOS ANALITICOS EN LA PREDICCIÓN DE SU ACCIÓN BIOLÓGICA. *Influencia del tipo de material combustionado ( contiene N o no ? ) *Agregado de retardantes de la ignición *Forma física en la que se halla el polímero *Recinto donde se produce la combustión ( abierto o cerrado ) *Temperaturas que produce la ignición.

4 Controversia: HCN vs. CO Repetto y Martinez (Night club) Repetto y Martinez (Night club) Elkius & Coleman: CO principal agente Elkius & Coleman: CO principal agente Montgomery: HCN no tan relevante Montgomery: HCN no tan relevante Purser: Competencia de nitrilos en la acción del HCN, anula el efecto Purser: Competencia de nitrilos en la acción del HCN, anula el efecto Alarie: CO es más responsable de los óbitos que el HCN. Alarie: CO es más responsable de los óbitos que el HCN. Zamecknic & Tam: Incendio avión HCN Zamecknic & Tam: Incendio avión HCN Syminngton: HCN no es secundario Syminngton: HCN no es secundario Walsh et al: HCN incidencia en USA. Walsh et al: HCN incidencia en USA.

5 VíctimaMonóxido de Carbono en % de saturación de carboxihemoglobina Ácido Cianhídrico (en mg/kg) N.D 35N.D RESULTADOS

6 I.Análisis mediante Test de Pearson, 2 para determinar si existía relación estadística entre el HCN y el %COHb en sangre: 2 = 8.25 ( 2 teórico = 2.09; grados de libertad = 9, =0.05) => %COHb y concentración en sangre de HCN no son variables independientes. Se obtuvo una razón: (COHb) / (HCN)= constante

7 II. Evaluación de la contribución de cada tóxico por medio de índices, IL ILco = (COHb) – x x IL CN = ( HCN ) - y y Zona II Zona III

8 Zonas delimitadas por ILco = 0 e ILHCN = 0 Zona I: Individuos con niveles subletales de COHb y HCN en sangre. Zona I: Individuos con niveles subletales de COHb y HCN en sangre. Zona II: Individuos cuyo deceso se atribuye principalmente al HCN. Zona II: Individuos cuyo deceso se atribuye principalmente al HCN. Zona III: Individuos cuyo deceso se atribuye principalmente al CO. Zona III: Individuos cuyo deceso se atribuye principalmente al CO. Zona IV: Individuos en los que ambos gases serían responsables del deceso. Zona IV: Individuos en los que ambos gases serían responsables del deceso.

9 Métodos analíticos aplicados en la actualidad: Microdifusión para ambos. Microdifusión para ambos. GC-NP para HCN GC-NP para HCN Cooximétrico para CO Cooximétrico para CO Gettler & Freimuth para CO Gettler & Freimuth para CO

10 Estudio postmortem de Dietilenglicol Dietilenglicol ( DEG ) : Dietilenglicol ( DEG ) : Paísaño Victms fatales Fuente USA Excipiente producto farmacéutico farmacéutico South Africa 19677desconocido Spain19855 Excipienteproducto farmacéutico India198614Glicerina Nigeria Banglades h Excipiente Farmacéutico Argentina Excipiente (propóleos) Haiti Excipiente farmacéutico Episodios de Intox.masivas Informados. Reseña del caso argentino.

11 Objetivos : a) Estimación de la dosis letal en episodio argentino b) Detección postmortem de DEG en órganos y su posible mecanismo de retención. c) Naturaleza de la fracción semicristalina formada en la fase pre analítica. d) Estudiar diferentes correlaciones entre los parámetros de medio interno con las dosis letales estimadas para el dietilenglicol.

12 Biotransformación 2 EG GAld Glicolato Gliox Ca OXALATO deposición 2 EG GAld Glicolato Gliox Ca OXALATO deposición DEG DEG HE-Acetaldehido HEAA HE-Acetaldehido HEAA no deposición de cristales no deposición de cristales

13 Materiales y Métodos Determinación de parámetros bioquímicos ensayados: pO2, pH, Cl-, HCO3-,Na+, K+, GAP aniónico, EB. GAP anionico (mEq/L) = (Na+) + (K+) – (Cl-) – (HCO3-) Análisis Químico: Para jarabe de propóleos: Cualitativo por NMR y GC-FID Cuantitativo por GC - FID, IS: EG. Ti=120ºC, 1 min, Grad: 15ºC/min, Tf: 200ºC. Carrier: N 2, 12 cm 3 /min. FID 250ºC Para sangre y vísceras: Extracción directa con metanol Análisis por GC-FID Para fracción semicristalina: TLC-FID; GC-FID. Clasificación de víctimas en grupos acorde al tiempo de sobrevida Grupo I (hasta 3 d.) Grupo II (4 a 5 d.) Grupo III (6 a 21 d.)

14 Resultados : VictimaedadsexoTSDEGsDEGvterapiaT.P.M.AMDRDH 1Z59F21--Y a56F11--N * 3Cu62M5--Y Y60F7--N L57F3+-N * 6Ca59M2+-N * 7P93F4-NRY * 8M66M8-NRN * 9G65F6-NRN-++NC+++* 10Ga66F6-NRY * 11Cr50M10--N Ru54F6-NRN * 13Ot83M9--N14NC Fr70M1++N Fa60M5--N N52F8-NRN * 17Nn53F7-NRY-++ ++* 18D50-60MDNR-DExhumacDDD* 19D55-60MDNR-DExhumacDDD* 20NC70-80FDNR-N214NC NC*

15 RMN del jarabe IS DEG

16 Composición de la fracción semicristalina

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18 Estado Acido - base y DEG en sangre y víscera GrupoVictimSex Peso (Kg) Edad (años) DEG Sang DEG viscera pHEB(MEq/L) GAP (MEq/L) Tiempo sobrev (Días) 11M M F M F7593-NR M F9454-NR F M7466-NR M F M F F7165-NRNRNRNR 15F6866-NRNRNRNR

19 DEG (%P/V) y PG (%P/V) identificados en muestras de propóleos y estimación de dosis letal GrupoVictim DEG %P/V DEG %P/VPG %P/V %P/V DEG (mg) si es consumido 5 ml jarabe DEG (mg) si consumido 20 ml de jarabe DEG (mg/Kg) si consume 5 ml de jarabe DEG (mg/Kg)si consume 20 ml de jarabe

20 Relación entre dosis de DEG y GAP aniónico para 13 de las 15 víctimas estudiadas. (r2= 0.63 y 0.78). grupo 1, grupo II, grupo III

21 Conclusión: El DEG parece seguir una vía metabólica donde no existe ruptura de la molécula. El DEG parece seguir una vía metabólica donde no existe ruptura de la molécula. En la Etapa de aislamiento puede generarse una fracción orgánica compleja que retendría al DEG por codisolución y/o adsorción, formando una fase mesomórfica con interacciones polares, negativizando falsamente los análisis de laboratorio. En la Etapa de aislamiento puede generarse una fracción orgánica compleja que retendría al DEG por codisolución y/o adsorción, formando una fase mesomórfica con interacciones polares, negativizando falsamente los análisis de laboratorio. Podría ser retenido por tejidos en etapa postmortal, principalmente en aquellos órganos ricos en lípidos complejos (Ac.Grasos Libres y fosfolípidos). Podría ser retenido por tejidos en etapa postmortal, principalmente en aquellos órganos ricos en lípidos complejos (Ac.Grasos Libres y fosfolípidos). Las dosis letales encontradas fueron mucho menores a las consignadas en la literatura y es la dosis menor registrada hasta hoy( mg/Kg). Las dosis letales encontradas fueron mucho menores a las consignadas en la literatura y es la dosis menor registrada hasta hoy( mg/Kg). Se verificó una buena correlación entre parámetros de medio interno. Por ejemplo para el Grupo I : mayores niveles de GAP aniónico y más bajos de EB. Se verificó una buena correlación entre parámetros de medio interno. Por ejemplo para el Grupo I : mayores niveles de GAP aniónico y más bajos de EB. La correlación entre dosis estimada y GAP aniónico fue buena mostrando r2=0.63 y r2=0.78 La correlación entre dosis estimada y GAP aniónico fue buena mostrando r2=0.63 y r2=0.78

22 Metanol: Investigación postmortem en una intoxicación masiva. Reseña del caso que nos ocupa. Cuestiones oscuras y controvertidas: Ácido fórmico como metabolito Ácido fórmico como metabolito Es el metanol buen indicador de intoxicación ? Es el metanol buen indicador de intoxicación ? Relación de [C] entre órganos Relación de [C] entre órganos Tiempo de supervivencia de las víctimas Tiempo de supervivencia de las víctimas Tipo de terapia aplicada ( hemodiálisis? ) Tipo de terapia aplicada ( hemodiálisis? )

23 Clasificación de las víctimas en grupos en la intoxicación por metanol Grupo 1: individuos con tratamiento y sobrevida de hasta 10 días (5 casos). Grupo 1: individuos con tratamiento y sobrevida de hasta 10 días (5 casos). Grupo 2: recibieron tratamiento y sobrevivieron hasta 3 días (4 casos). Grupo 2: recibieron tratamiento y sobrevivieron hasta 3 días (4 casos). Grupo 3: no recibieron tratamiento y murieron en pocas horas (6 casos). Grupo 3: no recibieron tratamiento y murieron en pocas horas (6 casos). Metodología para la determinación de metanol y ácido fórmico A. Metanol 1 ml de sangre o 1 g de víscera y carbonato de potasio, 1 ml de alcohol isopropílico (SI), en viales sellados durante 30 a 45 minutos a 60ºC. Inyección en GC-FID, columna empacada con 0.3% Carbowax 1500-graphapack 60/80, isotérmica 100ºC. A. Metanol 1 ml de sangre o 1 g de víscera y carbonato de potasio, 1 ml de alcohol isopropílico (SI), en viales sellados durante 30 a 45 minutos a 60ºC. Inyección en GC-FID, columna empacada con 0.3% Carbowax 1500-graphapack 60/80, isotérmica 100ºC. B. Acido fórmico (head space). Cromatografía gaseosa y detector FID previa transformación en metilformiato. B. Acido fórmico (head space). Cromatografía gaseosa y detector FID previa transformación en metilformiato. Muestra con 250 l de ácido sulfúrico concentrado + 15 µl acetonitrilo (SI) + 15 l de metanol para convertir el ácido fórmico en formiato de metilo. Cromatógrafo Gaseoso columna Megabore DBWax de J&W, 30 m long mm de diámetro interno. Ti 35°C, 1 minuto y 10°C/min, hasta 100°C Tf. T inyección y detector = 150 °C. Muestra con 250 l de ácido sulfúrico concentrado + 15 µl acetonitrilo (SI) + 15 l de metanol para convertir el ácido fórmico en formiato de metilo. Cromatógrafo Gaseoso columna Megabore DBWax de J&W, 30 m long mm de diámetro interno. Ti 35°C, 1 minuto y 10°C/min, hasta 100°C Tf. T inyección y detector = 150 °C. Reseña del caso de intoxicación masiva con metanol. En Argentina, en febrero y setiembre del año 1993, intoxicación masiva por ingesta de vinos en damajuanas contaminadas con alcohol metílico, agregado intencionalmente. El saldo 47 víctimas fatales y más de trescientas personas afectadas. En Argentina, en febrero y setiembre del año 1993, intoxicación masiva por ingesta de vinos en damajuanas contaminadas con alcohol metílico, agregado intencionalmente. El saldo 47 víctimas fatales y más de trescientas personas afectadas. En el trabajo se estudiaron 15 víctimas fatales debido a falta de disponibilidad de datos para el resto. La intoxicación se manifestó en forma rápida y los síntomas: oliguria (2 a 12 hs posteriores a la ingestión) a la anuria completa en 24 a 48 hs. Todos los casos mostraron acidosis metabólica. Entre las secuela: ceguera, que algunos padecen hasta hoy. En el trabajo se estudiaron 15 víctimas fatales debido a falta de disponibilidad de datos para el resto. La intoxicación se manifestó en forma rápida y los síntomas: oliguria (2 a 12 hs posteriores a la ingestión) a la anuria completa en 24 a 48 hs. Todos los casos mostraron acidosis metabólica. Entre las secuela: ceguera, que algunos padecen hasta hoy.

24 Concentración de metanol y ácido fórmico (g/L or g/Kg) en grupo 1, 2 y3 en sangre, hígado, pulmón, cerebro y riñón.

25 Gráfico mostrando la correlación entre a) concentración de ácido fórmico en cerebro y la concentración correspondiente en sangre (r2=0.86, n=15), b) ácido fórmico en riñón y pulmón para los.grupo 1, grupo 2, grupo 3. La mejor correlación de concentraciones corresponde a sangre vs cerebro, con un coeficiente de regresión lineal r2= 0.86, para las 15 muestras analizadas. Los coeficientes de correlación entre sangre y otros tejidos fueron: sangre vs hígado, con r2=0.69; sangre vs riñón, con un coeficiente r2=0.68 y sangre vs pulmón, con un coeficiente de regresión r2=0.56. La mejor correlación entre órganos fue la de pulmón vs riñón, para cada grupo con r2= 0.91, 0.84 y 0.87, para los grupos 1, 2 y 3 respectivamente. Otras relaciones entre tejidos fueron estudiadas pero no mostraron una buena

26 La siguiente ecuación fue definida para estudiar el grado de letalidad debido al ácido fórmico en intoxicaciones por metanol, teniendo en cuenta el tiempo de sobrevida y el tipo de terapia aplicada (etílica). LI= (concentración de ácido fórmico en sangre/0.5) 100

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28 VíctimLapso entre muerte- tiempo de análisis MetanolÁcido Fórmico (días )sangreórganos sangre órganos 1a1a a a a a b b NA b 23ND+++ 9 b 4ND b b NA b b 2ND b 69 c ND b 69 c ND+ + Incidencia del lapso entre muerte y el análisis de metanol y ácido fórmico en 15 víctimas estudiadas, El tiempo transcurrido incide poco en la detección de ácido fórmico

29 Conclusión: El metanol no sería un buen parámetro en el pronóstico de sobrevida, principalmente cuando han transcurrido entre 36 a 48hs. No tomar el dato del informe analítico para aseverar causante del óbito en un análisis post mortem. El ácido fórmico, más bien que el metanol, resultaría el mejor analito de estudio. La concentración de ácido fórmico en sangre correlaciona bien con la concentración en cerebro (r2=0.86) e hígado (r2=0.69) y poco para sangre vs. pulmón (r2=0.56). La mejor correlación entre órganos fue hallada para pulmón vs. riñón para cada grupo definido, con r2=0.91, 0.84 y 0.87 para los grupos 1, 2 y 3 respectivamente. Esto último resultó muy importante porque, transcurridos dos o tres días de la intoxicación y con ausencia de alcohol metílico en sangre, la relación entre órganos, principalmente pulmón/ riñón, permitiría efectuar una mejor interpretación sobre el causal de óbito en estas intoxicaciones. La expresión matemática que fue definida para LI (índice de letalidad) ayuda a la interpretación del grado de toxicidad del episodio considerado y permite asociar dicho guarismo a las concentraciones de ácido fórmico en distintos órganos de las víctimas (Vg: hígado, pulmón, cerebro y riñón), teniendo en cuenta el tiempo de sobrevida y el tipo de terapia aplicada; comprobándose así que el modelo predictivo solo es válido para pacientes sometidos a terapia etílica y no a hemodiálisis. La introducción del índice de letalidad, IL, y las relaciones de concentración de ácido fórmico entre órganos permite arribar a la conclusión del causal de óbito y presenta una buena correlación con la suma de concentraciones de ácido fórmico en hígado, pulmón, cerebro y riñón (r2 = 0.80). Las concentraciones de ácido fórmico correlacionaron bien con los efectos clínicos y con la severidad del cuadro en humanos, corroborando investigaciones de Liesivuori y Savolainen (1991) efectuadas en especie animal.

30 Conclusión Final: Tipo de terapia aplicada y sobrevida influyen en la detección de metanol y ácido fórmico Tipo de terapia aplicada y sobrevida influyen en la detección de metanol y ácido fórmico Ácido fórmico constituye el mejor indicador de la intoxicación metílica especialmente si ha transcurrido 72 horas desde la ingestión. Ácido fórmico constituye el mejor indicador de la intoxicación metílica especialmente si ha transcurrido 72 horas desde la ingestión. La relación de concentración entre órganos puede facilitar la interpretación post mortem de la intoxicación La relación de concentración entre órganos puede facilitar la interpretación post mortem de la intoxicación El cerebro constituye un buen órgano cuando la muerte transcurre más de una semana posterior a la ingesta. El cerebro constituye un buen órgano cuando la muerte transcurre más de una semana posterior a la ingesta.


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