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BOLILLA 1: ENZIMAS. Introducción: Nomenclatura y clasificación. Determinación de la actividad enzimática. Unidades. Complejo enzima-sustrato. Sitio activo.

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1 BOLILLA 1: ENZIMAS. Introducción: Nomenclatura y clasificación. Determinación de la actividad enzimática. Unidades. Complejo enzima-sustrato. Sitio activo. Cinética enzimática. Factores que modifican la actividad enzimática. Tipos de Inhibiciones. Regulación. Enzimas alostéricas. Propiedades y cinética. Control por proteínas: activación proteolítica. Modulación covalente. Isoenzimas. Regulación de la expresión génica: represión e inducción enzimática.

2 HISTORIA A fines del siglo XVIII: catalizadores en estudios de la digestión de la carne por secreciones del estómago. Louis Pasteur, 1850 (fermentos –azúcar alcohol- de la levadura) Eduard Buchner, 1897 (levaduras) ENZIMAS Fredrick Kühne fue el primero en llamar a los fermentos: ENZIMAS James Summer, 1926 (ureasa) John Northrop y Moses Kunitz, 1930 (pepsina, tripsina y quimotripsina) Estructura y función 1963: 1º Secuencia de aminoácidos de la ribonucleasa pancreática bovina A 1965: 1º Estructura por RX de la Lisozima de clara de huevo de gallina 1983: Sidney Altman y Col. Observaron que el RNA de la ribonucleasa tiene actividad catalítica.

3 ENZIMAS - FUNCIÓN En los seres vivos se producen reacciones químicas para: Transformar los nutrientes de los alimentos para obtener energía. Transformar nutrientes simples en moléculas complejas y viceversa. Obtener materia prima para la síntesis de nuevas moléculas. Degradar componentes celulares una vez cumplida su vida útil. Extraer energía desde combustibles por oxidación. Polimerizar subunidades para formar macromoléculas.

4 Las transformaciones bioquímicas en los seres vivos ocurren: a gran velocidad con gran especificidad en condiciones muy moderadas de temperatura, pH, presión, etc. Un catalizador es una sustancia capaz de acelerar una reacción química sin formar parte de los productos finales ni desgastarse en el proceso.

5 ENZIMAS Los catalizadores biológicos son macromoléculas llamadas enzimas Actividad catalítica: depende de la integridad de su conformación proteica nativa La mayoría de las enzimas son proteínas, con la excepción de un pequeño grupo de moléculas de RNA catalítico, llamadas ribozimas.

6 PROTEINAS y RNA PROTEINAS y RNA (Ribozimas): Estructura terciaria y cuaternaria SITIO DE UNION AL SUSTRATO SITIO DE UNION AL SUSTRATO: Uniones no Covalentes (puente de hidrógeno, hidrofóbicas, electrostáticas) NECESITAN DE FACTORES ENZIMATICOS NECESITAN DE FACTORES ENZIMATICOS: Inorgánicos (metales) y orgánicos (Coenzimas) ESPECIFICIDAD DE SUSTRATO ESPECIFICIDAD DE SUSTRATO: Estéreo-especificidad y especificidad geométrica SON REGULABLES SON REGULABLES: La síntesis de la proteína, su actividad y degradación. CARACTERISTICAS DE LAS ENZIMAS

7 COMPARTIMENTALIZACION COMPARTIMENTALIZACION: Diferente localización dentro de la célula. SISTEMAS MULTIENZIMATICOS SISTEMAS MULTIENZIMATICOS: Enzimas relacionadas agrupadas formando verdaderos complejos. ENZIMAS MULTIFUNCIONALES ENZIMAS MULTIFUNCIONALES: Una enzima que presenta varios sitios catalíticos distintos en una misma cadena polipeptídica. DISTRIBUCION DE LAS ENZIMAS

8 Oxido-reducción Rotura y formación de enlaces C-C Reorganizaciones internas Transferencia de grupos Reacciones de condensación Tipos de reacciones catalizadas por enzimas

9 NOMENCLATURA Y CLASIFICACIÓN DE ENZIMAS Nombre común : nombre de uso cotidiano asa + nombre del sustrato de la reacción Ejemplo: sacarasa, ureasa, amilasa, etc Nombres arbitrarios Ej: ptialina salival, pepsina del jugo gástrico, etc. Nombres según el tipo de reacción catalizada. Ej: deshidrogenasas, carboxilasas, etc.

10 Nombre sistemático: Unión Internacional de Bioquímica y Biología Molecular (IUBMB) Se asigna a cada enzima un nombre descriptivo y un número que permite identificarla inequívocamente Nombre común: Hexoquinasa Nombre sistemático: ATP: glucosa fosfotransferasa Código de 4 dígitos: Clase 2: transferasa Subclase 7: fosfotransferasa Subsubclase 1: fosfotransferasa con un grupo hidroxilo como aceptor N° de orden de la enzima en su subclase 1: glucosa como aceptor del grupo fosfato

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12 1- OXIDORREDUCTASAS: DESHIDROGENASAS, OXIDASAS, OXIGENASAS, REDUCTASAS, PEROXIDASAS 2- TRANSFERASAS: TRANSCARBOXILASAS, TRANSMETILASAS Y TRANSAMINASAS. 3- HIDROLASAS: ESTERASAS, FOSFATASAS, PEPTIDASAS. 4- LIASAS: DESCARBOXILASAS, HIDRATASAS, DESHIDRATASAS, DESAMINASAS. 5- ISOMERASAS: EPIMERASAS, MUTASAS. 6- LIGASAS: SINTETASAS, CARBOXILASAS

13 COFACTORES Según su modo de interacción con la enzima COENZIMAS Unión laxa a la enzima Actuaría como co-sustrato Son moléculas orgánicas pequeñas Muchas se encuentran libres y solo se unen a la enzima en el momento de la catálisis GRUPO PROSTÉTICO Molécula orgánica no proteica Se une fuertemente a la enzima Solo se separa por desnaturalización IONES INORGÁNICOS Aniones - cationes

14 COFACTORES Iones inorgánicos: Fe 2+ Mg 2+ Mn 2+ Zn 2+ HOLOENZIMA HOLOENZIMA = Enzima total APOENZIMA APOENZIMA + Proteína Termolábil No dializaCOENZIMA No proteínica Termoestable En el caso de las coenzimas se forma un complejo: Oxidorreductasas, transferasas, isomerasas y ligasas requieren coenzimas

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17 PROPIEDADES DE LAS ENZIMAS LOCALIZACIÓN INTRACELULAR DE LAS ENZIMAS

18 PROPIEDADES DE LAS ENZIMAS SITIO ACTIVO Región de la molécula enzimática a la que se une el sustrato por uniones no covalentes (puente de hidrógeno, hidrofóbicas, electrostáticas). Es una agrupación de un número no muy grande de aminoácidos distribuidos espacialmente de manera precisa.

19 Sitio de unión Sitio catalítico Hipótesis de Fischer: estructuras rígidas Hipótesis de Koshland: estructuras adaptables

20 ZIMÓGENOS Algunas enzimas se sintetizan en la célula de origen al estado de PRECURSORES INACTIVOS llamados zimógenos, proenzimas o preenzimas. Ej: Enzimas digestivas SISTEMAS MULTIENZIMÁTICOS 1.Varias enzimas diferentes cuyas acciones se complementan. 2.Están ordenados, generalmente en membranas, de modo que el producto de la reacción catalizada por la primera enzima es recibido como sustrato por la segunda y así sucesivamente. 3.Las transformaciones se producen según la secuencia establecida por la disposición espacial de los catalizadores. Ej: Cadena Respiratoria ENZIMAS MULTIFUNCIONALES Presentan varios sitios catalíticos distintos en una misma cadena polipeptídica. Ej: ácido graso sintasa.

21 Catálisis enzimática trabajo Las células y organismos vivos deben realizar distintos tipos de trabajo para permanecer vivos y reproducirse. La síntesis continua de componentes celulares requiere de trabajo químico La acumulación y retención de sales contra un gradiente de concentración implica la realización de un trabajo osmótico La contracción muscular o el movimiento bacteriano representa un trabajo mecánico

22 Determinación de la actividad enzimática Se puede determinar, midiendo: La cantidad de producto formado O de sustrato consumido En un tiempo dado Como una sumatoria de todos los factores requeridos para la reacción

23 ACTIVIDAD ESPECÍFICA Es una expresión que indica la pureza relativa de una preparación enzimática. Relaciona Actividad Enzimática, no con el volumen de muestra, sino con el total de proteínas existentes en la misma. Se define como: UNIDADES DE ENZIMA POR MG DE PROTEÍNAS PRESENTES EN LA MUESTRA

24 ACTIVIDAD ENZIMATICA Unidades Internacionales Cantidad de enzima que cataliza la transformación de 1 μmol (10 -6 mol) de Sustrato por minuto: E Sustrato Producto U.I. = mol de S transformados minuto Siempre bajo condiciones definidas de pH y temperatura

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26 Para todo esto, los seres vivos requieren y utilizan la energía de su entorno La cantidad de energía realmente transformable en trabajo se denomina energía libre y ésta siempre será ligeramente inferior a la variación de energía total, ya que una parte de la misma se disipa en forma de calor

27 La variación de energía libre ( G) Energía de Gibbs de una reacción química es una expresión cuantitativa de lo lejos que se encuentra el sistema del equilibrio. Aquellas reacciones que liberan energía libre se denominan exergónicas. Dado que los productos de estas reacciones tienen menor energía libre que los reactivos, G es negativa. Aquellas reacciones en las que los productos poseen mayor energía libre que los reactivos son endergónicas y G es positiva.

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29 estado de transiciónbarrera de activación El estado de transición o barrera de activación, representa los cambios que se generan en la molécula del S. Las barreras de activación son importantes para la estabilidad de las biomoléculas. Es por esto que las reacciones sin catalizar tienden a ser muy lentas. Todas las moléculas biológicas son muy estables al pH neutro, temperatura suave y ambiente acuoso en el interior de las células. Todas las reacciones químicas celulares se llevan a cabo porque las enzimas actúan disminuyendo la barrera energética entre el S y el P

30 FACTORES QUE AFECTAN LA VELOCIDAD DE LA REACCIÓN CONCENTRACIÓN DE ENZIMA Cantidad saturante de sustrato, pH y T°C constantes ACTIVIDAD ENZIMÁTICAACTIVIDAD ENZIMÁTICA CONCENTRACIÓN DE ENZIMA Se establece la relación entre Cantidad y Actividad de enzima Velocidad de reacción directamente proporcional a la concentración de enzima

31 FACTORES QUE AFECTAN LA VELOCIDAD DE LA REACCIÓN TEMPERATURA Temperaturaóptima [E], [S], pH: constantes

32 pH óptimo PH ÓPTIMO ES AQUEL EN EL CUAL EL ESTADO DE DISOCIACIÓN DE LOS GRUPOS ESENCIALES ES EL MÁS APROPIADO PARA INTERACCIONAR EN EL COMPLEJO ES Los cambios del pH del medio afectan el estado de ionización de grupos funcionales de las moléculas de E y S. Para la formación del [ES] es necesaria una correcta distribución de las cargas en ambas moléculas

33 FACTORES QUE AFECTAN LA VELOCIDAD DE LA REACCIÓN EFECTO DEL pH [E], T°C, [S]: constantes

34 FACTORES QUE AFECTAN LA VELOCIDAD DE LA REACCIÓN CONCENTRACIÓN DEL SUSTRATO [E], pH, T°C: constantes Curva hiperbólica Reacción de 1° orden Reacción de primer orden: existe proporcionalidad entre velocidad y [S].

35 ECUACIÓN DE MICHAELIS- MENTEN (1913) Relación precisa entre velocidad inicial y [S] Constante de Michaelis ( Km) Es característica de una enzima y su sustrato particular Refleja la afinidad del sustrato por la enzima. Km es numéricamente igual a la concentración del sustrato que corresponde a una velocidad de reacción igual a la mitad de la velocidad máxima. En condiciones definidas de pH, T°C, Km tiene un valor fijo para cada enzima y sirve para caracterizarla.

36 Orden de la reacción Cuando [S] es menor a Km, la velocidad de reacción es proporcional a la [S] velocidad de reacción es de primer orden por lo tanto la velocidad de reacción es de primer orden con respecto al sustrato. Cuando [S] es mayor a Km, la velocidad de reacción es constante e igual a Vmax velocidad de reacción es de orden cero por lo tanto la velocidad de reacción es de orden cero con respecto a la concentración del sustrato.

37 ECUACIÓN DE MICHAELIS- MENTEN Cinética del estado estacionario E + PESE + S k1k1 k -1 k2k2 V 0 = Velocidad inicial de la reacción Vmáx= Velocidad Máxima Km= constante de Michaelis [S]= concentración del sustrato Reacción de orden cero Reacción de 1° orden

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39 La ecuación de Michaelis- Menten puede ser transformada algebraicamente en ecuaciones utilizables para la determinación práctica del valor de Km. Es decir, transformamos matemáticamente una curva hiperbólica en una recta. Al invertir la ecuación de Michaelis- Menten se obtiene la ecuación de una recta llamada:LINEWEAVER-BURK

40 ECUACIÓN DE LINEWEAVER-BURK Ordenada al origen = 1/V máx. Intersección c/eje x = - 1/K m El valor de km guarda relación inversa con la afinidad de la E por el S A MAYOR AFINIDAD, MENOR VALOR DE Km


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