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BASES MOLECULARES DE LA RESPUESTA A LA QUIMIOTERAPIA Y ANÁLISIS FARMACOGENÓMICO DE DIANAS INTRACELULARES Marçal Pastor-Anglada DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA.

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1 BASES MOLECULARES DE LA RESPUESTA A LA QUIMIOTERAPIA Y ANÁLISIS FARMACOGENÓMICO DE DIANAS INTRACELULARES Marçal Pastor-Anglada DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR, UNIVERSIDAD DE BARCELONA CURSO DE POST-GRADO EN GENÓMICA Y PROTEÓMICA 10 de Febrero de 2005

2 MECANISMOS DE ACCIÓN DE LOS FÁRMACOS DERIVADOS DE NUCLEÓSIDOS ASPECTOS BÁSICOS DE LOS TRANSPORTADORES DE NUCLEÓSIDOS (NTs) FARMACOLOGÍA DE LOS NTs PATRONES DE EXPRESIÓN DE NTs E IMPLICACIONES CLÍNICAS ANÁLISIS FARMACOGENÓMICO DE LA ACCIÓN DE FÁRMACOS DERIVADOS DE NUCLEÓSIDOS

3 QUIMIOTERAPIA. MECANISMOS DE ACCIÓN Mayoritarimente análogos de nucleósidos. Antimetabolitos Interferencia en la síntesis de nucleótidos. Acción en fase S. Incorporación a DNA y RNA. Reparación---Radiosensibilización Integridad mitocondrial Arresto en ciclo o muerte por apoptosis. Adaptado de Pastor-Anglada et al., Trends in Pharmacological Sciences 19: , 1998

4 GEMCITABINA. MECANISMO DE ACCIÓN Fosforilada por la dCK y TK2 O HO HO F HN N NH 2 O F O HO HO F HN N NH 2 O F O HO HO F HN N NH 2 O F -P O HO HO F HN N NH 2 O F -PP dFdC dFdCMP Desfosforilada por la 5-NT I Detoxificación a dFdUMP y dFdU dCDA dCMPdA dFdCDP Quinasas O HO HO F HN N NH 2 O F -PPP dFdCTP

5 GEMCITABINA. MECANISMO DE ACCIÓN O HO HO F HN N NH 2 O F O HO HO F HN N NH 2 O F dFdC Inhibición de la citidina desaminasa y la dCDA. Inhibición de la timidilato sintasa. O HO HO F HN N NH 2 O F -P dFdCMP Inhibición de la citidina desaminasa y la dCDA. O HO HO F HN N NH 2 O F -PP dFdCDP Inhibición de la ribonucleótido reductasa. dFdCTP O HO HO F HN N NH 2 O F -PPP Incorporación a DNA y RNA Radiosensibilización

6 CAPECITABINA. MECANISMO DE ACCIÓN Inhibición TS Incorporación a RNA y DNA DIANAS DEL 5-FU HN NH O O F 5-fluorouracilo HN NH NH2 O F HN NH O O F Carboxil esterasa Citidina desaminasa Timidina fosforilasa 5-deoxy-5-fluorouridine 5-deoxy-5-fluorocytidine N4-pentyloxycarbamyl-5-deoxy-5-fluorocytidine HN NH NH2 O F Capecitabina 5-DFC 5-DFUR 5-FU HN NH NH2 O F

7 EJEMPLOS DE MECANISMOS DE RESISTENCIA A FLUOROPIRIMIDINAS RESISTENCIA A GEMCITABINA. METABOLISMO dCK TK2 Disminución de la actividad causa resistencia Baja actividad aumenta la sensibilidad debido a que fosforila más eficientemente el nucleósido natural dCyd 5-NT La sobreexpresión causa resistencia al desfosforilar los nucleótidos a nucleósidos RRUn aumento de la actividad o falta de inhibición de la ribonucleótido reductasa causa resistencia a gemcitabina.

8 NUEVOS ELEMENTOS IMPLICADOS EN LAS BASES MOLECULARES DE LA RESISTENCIA A LA QUIMIOTERAPIA RESISTENCIA A GEMCITABINA: TRANSPORTADORES DE NUCLEÓSIDOS?? Mutaciones en el gen p53. Proteínas de la familia Bcl-2. Caspasa 8. Vía PI3K. DNA y RNA polimerasas. Metabolismo intracelular. TRANSPORTADORES DE NUCLEÓSIDOSTRANSPORTADORES DE NUCLEÓSIDOS

9 MECANISMOS DE ACCIÓN DE LOS FÁRMACOS DERIVADOS DE NUCLEÓSIDOS ASPECTOS BÁSICOS DE LOS TRANSPORTADORES DE NUCLEÓSIDOS (NTs) FARMACOLOGÍA DE LOS NTs PATRONES DE EXPRESIÓN DE NTs E IMPLICACIONES CLÍNICAS ANÁLISIS FARMACOGENÓMICO DE LA ACCIÓN DE FÁRMACOS DERIVADOS DE NUCLEÓSIDOS

10 UP-HILLDOWN-HILL S S S S S Na S IN OUT IN OUT CNT Concentrative Nucleoside Transporter ENT Equilibrative Nucleoside Transporter Mecanismos de transporte de nucleósidos al interior de la célula

11 NH 3 + CO hENT family ei ENT2 es ENT1 Uridine NBTI PROTEIN GENELENGTH IDENTITYINHIBITORS (IC 50 )SUBSTRATES (Km) TISSUE DISTRIBUTION hENT1SLC29A %NBTI 0.4nM Dip 5nMU 0.26mM A 0.04mM Ubiquitous, plasma, perinuclear I 0.17mM C 0.58mM and mitochondrial membranes hENT2SLC29A2 456NBTI 2.8 M Dip 356nMU 0.25mM A 0.14mM Ubiquitous, highly abundant I 0.05mM C 5.61mM in skeletal muscle Nuclebases (hypoxanthine) ENTs (SLC29), transportadores de baja afinidad y amplia selectividad Pastor-Anglada, M.; Baldwin, S.A. Drug Development Research 52: , 2001

12 NH 3 + CO hCNT family CNTs (SLC28), transportadores de alta afinidad, relativamente específicos N CNT 1-3 NaUridine PROTEIN GENELENGTHIDENTITYSTOICHIOMETRYSUBSTRATES (Km) TISSUE DISTRIBUTION hCNT1 SLC28A %and 48% 1-2Na/1NucleosideU M T 6 M Most epithelia, macrophages, (kidney, intestine) C 34 In.t. hCNT2 SLC28A % 1Na/1NucleosideU 80 M I 4.5 M Epithelia (liver), macrophages,brain, ilots, B,T cells, brain,heart,skel.muscle A 8 M T n.t. hCNT3 SLC28A Na/1NucleosideU 22 M T 21 M Widely distributed, not solved yet at the protein level I 53 M A 15 M Pastor-Anglada, M.; Baldwin, S.A. Drug Development Research 52: , 2001

13 Barrett and Grisham, 1995 Biochemistry Vias biosintéticas: LOS NUCLEÓSIDOS SON MOLÉCULAS CARAS Algunos tipos celulares, especialmente aquellos de alto recambio, dependen esencialmente de las vías de recuperación -ENTEROCITOS -CÉLULAS DEL SISTEMA INMUNE

14 Los transportadores de nucleósidos en la naturaleza Los CNTs humanos y de mamíferos tienen ortólogos en nemátodos, insectos, protozoos, levaduras, bacterias,.... La vía de recuperación está altamente conservada Role of nucleoside transporters SLC28 and SLC29 in cancer chemotherapy. Pastor-Anglada, M., Casado, F.J., en Deoxynucleoside analogs in cancer therapy (Peters, G.J., editor) Cancer Drug Discovery and Development book series. The Humana Press, Inc.Totowa, New Jersey, en prensa

15 Procesos celulares en los que los nucleós(t)idos están involucrados -Precursores de ácidos nucléicos (ARN y ADN) -Activadores en vías biosintéticas (p.e. UDP) -Unidades de transferencia de energía (ATP,GTP) -Coenzimas (NAD, FAD) -Moduladores de la fisiología celular (cAMP, ATP, Ado) La base de la quimioterapia radica en el aprovechamiento de las vías de recuperación de aquellas células que presentan elevados índices de proliferación

16 MECANISMOS DE ACCIÓN DE LOS FÁRMACOS DERIVADOS DE NUCLEÓSIDOS ASPECTOS BÁSICOS DE LOS TRANSPORTADORES DE NUCLEÓSIDOS (NTs) FARMACOLOGÍA DE LOS NTs PATRONES DE EXPRESIÓN DE NTs E IMPLICACIONES CLÍNICAS ANÁLISIS FARMACOGENÓMICO DE LA ACCIÓN DE FÁRMACOS DERIVADOS DE NUCLEÓSIDOS

17 LA GEMCITABINE (GEMZAR ), PERO NO LA FLUDARABINA, ES UN SUBSTRATO CAPTADO CON ALTA AFINIDAD APARENTE POR EL TRANSPORTADOR hCNT1 EJEMPLO DE SISTEMAS HETERÓLOGOS DE EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS TRANSPORTADORAS PARA DEFINIR PERFILES FARMACOLÓGICOS Lostao, M.P., Mata, J.F., Larrayoz, I.M., Inzillo, S.M., Casado, F.J., Pastor-Anglada, M. FEBS Letters 481: , 2000

18 K 0.5 ( M) % corriente uridina 0.5mM Uridine 37±7 (8)100 (8) Cytidine 29±8 (6) 47±7 (6) Thymidine 26±7 (4) 109±19 (4) Gemcitabine 18±5 (8) 33±5 (8) 5-DFUR 245±39 (7) 147±18 (7) V h =-50 mV Larráyoz, I.M., Casado, F.J., Pastor-Anglada, M., Lostao, M.P. Journal Biological Chemistry 279: , 2004.

19 La capecitabina (Xeloda ) es un profármaco oral de última generación utilizado en el tratamiento de tumores de colon y mama Capecitabina 5-desoxi-5-fluorocitidina 5-desoxi-5-fluorouridina (5-DFUR) 5-fluorouracilo Carboxilesterasa HÍGADO Citidina desaminasa HÍGADO - TUMORES? TImidina Fosforilasa TUMORES 5-DFUR, EL INTERMEDIARIO INMEDIATO DE 5-FU EN TUMORES, ES SUBSTRATO DEL TRANSPORTADOR CONCENTRATIVO DE ALTA AFINIDAD hCNT1 Mata, J.F., García-Manteiga, J.M., Lostao, M.P., Fernández-Veledo, S., Guillén-Gómez, E., Larrayoz, I.M., Lloberas, J., Casado, F.J., Pastor-Anglada, M. Molecular Pharmacology 59: , 2001

20 La expresión heteróloga de hCNT1 confiere sensibilidad a 5- DFUR, independientemente de las actividades equilibrativas endógenas. Mata, J.F., García-Manteiga, J.M., Lostao, M.P., Fernández-Veledo, S., Guillén-Gómez, E., Larrayoz, I.M., Lloberas, J., Casado, F.J., Pastor-Anglada, M. Molecular Pharmacology 59: , 2001 CHO wt CHO-vector CHO-hCNT1 -dipyridamol +dipyridamol

21 CÉLULAS TUMORALES PANCREÁTICAS. SENSIBILIDAD A GEMCITABINA EFECTO DE LA REINTRODUCCIÓN DE hCNT1 SOBRE LA ACCIÓN CITOTÓXICA DE LA GEMCITABINA HC1 NP-9 TANTO EN UNA EXPOSICIÓN A GEMCITABINA COMO EN UN PROTOCOLO DE TRIPLE EXPOSICIÓN AL FÁRMACO, LA PRESENCIA DE hCNT1 SENSIBILIZÓ LAS CÉLULAS AL TRATAMIENTO CON EL FÁRMACO ENSAYO DE CITOTOXICIDAD DE GEMCITABINA EN LOS CLONES DE NP-9 72 H DESPUÉS DE 90 MINUTOS DE INCUBACIÓN AL FÁRMACO PC1 García-Manteiga, J., Molina-Arcas, M., Casado, F.J., Mazo, A., Pastor-Anglada, M. Clinical Cancer Research 9: , 2003

22 IC50 ( M) Km ( M) Cytidine 4.5± ±0.7 Thymidine 12.55±1.93 ND AZT 1004± ±135 d4T 4525± ±4700 ddC 5730±222 NT 3tC >>20000 NT Gemcitabine ND 17±2 5-DFUR ND 209±51 Thymidine AZTd4T5-DFUR Cytidine ddC 3tC Gemcitabine Cano-Soldado, P., Larráyoz, I., Molina-Arcas, M., Casado, F.J., Martínez-Picado, J., Lostao, M.P., Pastor-Anglada, M. Antiviral Therapy 9: , 2004

23 Cytidine2-deoxycytidineddC Selectividad farmacológica de hCNT1 Cano-Soldado, P., Larráyoz, I., Molina-Arcas, M., Casado, F.J., Martínez-Picado, J., Lostao, M.P., Pastor-Anglada, M. Antiviral Therapy 9: , 2004

24 Deoxynucleoside transporters in cancer therapy. Pastor-Anglada, M., Casado, F.J. En Deoxynucleoside Analogs in Cancer Therapy (Peters, G.J., editor) Cancer Drug Discovery and Development book series. The Humana Press, Inc. Totowa, New Jersey. En prensa Pastor-Anglada, M., Molina-Arcas, M., Casado, F.J., Bellosillo, B., Colomer, D., Gil, J. Leukemia 18: , 2004 Perfiles farmacológicos preliminares de los transportadores hCNT y hENT

25 MECANISMOS DE ACCIÓN DE LOS FÁRMACOS DERIVADOS DE NUCLEÓSIDOS ASPECTOS BÁSICOS DE LOS TRANSPORTADORES DE NUCLEÓSIDOS (NTs) FARMACOLOGÍA DE LOS NTs PATRONES DE EXPRESIÓN DE NTs E IMPLICACIONES CLÍNICAS ANÁLISIS FARMACOGENÓMICO DE LA ACCIÓN DE FÁRMACOS DERIVADOS DE NUCLEÓSIDOS

26 LOS TRANSPORTADORES SON PRACTICAMENTE UBICUOS Y SU EXPRESIÓN ESTÁ ALTAMENTE CONDICIONADA POR EL ESTADO DE DIFERENCIACIÓN CELULAR Las células de hepatoma presentan un perfil diferente de expresión de CNT y ENT. La diferenciación de hepatocitos fetales con dexametasona induce CNT2. Valdés, R., Ortega, M.A., Casado, F.J., Felipe, A., Gil, A., Sánchez-Pozo, A., Pastor-Anglada, M. Gastroenterology 119: , 2000 del Santo, B., Valdés, R., Mata, J.F., Felipe, A., Casado, F.J., Pastor-Anglada, M. Hepatology 28: , 1998 CNT2 ENT1 ENT2 Del Santo, B., Tarafa, G., Felipe, A., Casado, F.J., Pastor- Anglada, M. Journal of Hepatology 34: , 2001 La expresión de estas proteínas es prácticamente ubicua o muy amplia

27 H&E G-6Pasa ¿PERO SE OBSERVA REALMENTE UNA PÉRDIDA DE EXPRESIÓN DE TRANSPORTDAORES CNT EN MODELOS IN VIVO? HEPATOCARCINOGÉNESIS INDUCIDA QUÍMICAMENTE GST GST rCNT2 Dragan, Y., Valdés, R., Gómez-Angelats, M., Felipe, A., Casado, F.J., Pitot, H.C., Pastor-Anglada, M. Hepatology 32: , 2000

28 SE DEMUESTRA POR PRIMERA VEZ LA PÉRDIDA DE EXPRESIÓN DE UN TRANSPORTADOR DE LA FAMILIA GÉNICA CNT1 EN UN MODELO ANIMAL DE CÁNCER H&E T-SV40 G-6Pasa rCNT1 MODELO DE RATA TRANSGÉNICA Alb-SV40 Dragan, Y., Valdés, R., Gómez-Angelats, M., Felipe, A., Casado, F.J., Pitot, H.C., Pastor-Anglada, M. Hepatology 32: , 2000

29 PATRONES DE EXPRESIÓN DE NTs E IMPLICACIONES CLÍNICAS evidencias de expresión diferencial de NTs en tumores primeros estudios clínicos (tumores sólidos y enfermedades linfoproliferativas)

30 CÉLULAS TUMORALES PANCREÁTICAS. EXPRESIÓN DE TRANSPORTADORES ANALISIS POR RT-PCR DE LA EXPRESIÓN DE hENT1, hENT2, hCNT1, hCNT2 y hCNT3 EN NPs LAS CUATRO LÍNEAS MUESTRAN ALTOS NIVELES DE mRNA DE hENT1 TAMBIEN SE DETECTA, AUNQUE EN MENOR MEDIDA EL mRNA DE hENT2 A PESAR DE LA AUSENCIA DE ACTIVIDAD CONCENTRATIVA DETECTADA EN LOS ENSAYOS DE TRANSPORTE TODAS LAS LÍNEAS NP EXPRESAN EL mRNA DE UNO O MÁS TRANSPORTADORES CONCENTRATIVOS. García-Manteiga, J., Molina-Arcas, M., Casado, F.J., Mazo, A., Pastor-Anglada, M. Clinical Cancer Research, 9: , 2003

31 PANEL DE ANTICUERPOS DESARROLLADOS CONTRA TRANSPORTADORES NT hCNT1aExtracellular No IHC hCNT1bIntracellular No IHC hCNT1aExtracellular hCNT2aIntracellular No hCNT2bIntracellular WESTERN hCNT3Intracellular hENT1aIntracellular IHC hENT1bIntracellular No hENT2Intracellular IHC WESTERN western ICC IHC M.Pastor Anglada, F.J.Casado Merediz, A.Felipe Campo, Method and in vitro kit for selecting a drug for chemotherapy WO 00/52477 Balagué Center, S.A. Países: ESTADOS UNIDOS DE AMERICA ; JAPON ; CANADA ; UNIÓN EUROPEA

32 Matrices de tejidos Tissue array n Analisis simultáneo de muchas muestras n Cilindros adecuados para IHQ 2 mm muestras 2 mm muestras 1.5 mm mm mm mm n Controles positivos y negativos internos n Tinción homogénea n Eficiente y rápido Tongue Uterus Lung Kidney Liver Breast

33 PATRONES DE EXPRESIÓN DE TRANSPORTADORES DE NUCLEÓSIDOS EN TUMORES GINECOLÓGICOS AC GF E D C B hCNT1hENT1hENT2 hCNT1hENT1hENT2 hCNT1 Expression of the nucleoside-derived drug transporters hCNT1, hENT1 and hENT2 in gynecological tumors. Farré,X..,Guillén-Gómez,E.,Sánchez, Hardisson, D., Plaza, Y., Lloberas, J., Casado, F.J., Palacios, J., Pastor-Anglada, M. International Journal of Cancer 112: , 2004

34 Ovarian carcinomas Expression -+++ hENT1 (n =90)8 (8.8 %)41 (45.6 %) hENT2 (n= 89)14 (15.7 %)54 (60.7 %)21 (23.6 %) hCNT1 (n = 90)30 (33.3 %)45 (50.0 %)15 (16.7 %) Endometrial carcinomas Expression -+++ hENT1 (n = 80)0 (0 %)27 (33.8 %)53 (66.2 %) hENT2 (n = 78)0 (0 %)47 (60.3 %)31 (39.7 %) hCNT1 (n = 79)12 (15.2 %)60 (75.9 %) 7 (8.9 %) Uterine cervix carcinomas Expression -+++ hENT1 (n = 117)5 (4.2 %)63 (53.9 %)49 (41.9 %) hENT2 (n = 117)2 (1.7 %)55 (47.0 %)60 (51.3 %) hCNT1 (n = 118)46 (39.0 %)33 (28.0 %)39 (33.0 %) SEMI-CUANTIFICACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS NT EN TUMORES GINECOLÓGICOS Expression of the nucleoside-derived drug transporters hCNT1, hENT1 and hENT2 in gynecological tumors. Farré,X..,Guillén-Gómez,E.,Sánchez, Hardisson, D., Plaza, Y., Lloberas, J., Casado, F.J., Palacios, J., Pastor-Anglada, M. International Journal of Cancer 112: , 2004

35 LA PÉRDIDA DE LA EXPRESIÓN DE hCNT1 SE ASOCIA CON SUBTIPOS HISTOLÓGICOS CONCRETOS DE TUMORES GINECOLÓGICOS Expression of hCNT1 in ovarian carcinomas by hystologic type Hystologic typeExpression -+ / ++ (%) Serous Mucinous Endometrioid Clear cell p = Expression of hCNT1 in uterine cervix carcinomas by hystologic type Hystologic typeExpression -+ / ++ (%) Adenocarcinoma Squamous cell p < Expression of the nucleoside-derived drug transporters hCNT1, hENT1 and hENT2 in gynecological tumors. Farré,X..,Guillén-Gómez,E.,Sánchez, Hardisson, D., Plaza, Y., Lloberas, J., Casado, F.J., Palacios, J., Pastor-Anglada, M. International Journal of Cancer 112: , 2004

36 evidencias de expresión diferencial de NTs en tumores primeros estudios clínicos (tumores sólidos y enfermedades linfoproliferativas) PATRONES DE EXPRESIÓN DE NTs E IMPLICACIONES CLÍNICAS

37 2-fluoroadenine-9- -D-arabinofuranoside La sensibilidad ex-vivo a la fludarabina se correlaciona con el transporte del fármaco mediado por proteínas ENT, pero no guarda correlación con sus niveles de ARNm p=0.029 r=0.488 p=0.006 r=0.591 Molina-Arcas, M., Bellosillo, B., Casado, F.J., Montserrat, E., Gil, J., Colomer, D., Pastor-Anglada, M. Fludarabine uptake mechanisms in B-cell chronic lymphocytic leukemia. Blood 101: , 2003

38 ENT1 AND ENT2 PROTEIN EXPRESSION IN CLL PATIENTS Equilibrative Nucleoside Transporter-2 (hENT2) Protein correlates with ex-vivo Sensitivity to Fludarabine in Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL)-cells. Molina-Arcas, M., Marcé, S., Villamor, N., Huber-Ruano, I., Casado, F.J., Bellosillo, B., Montserrat, E., Gil, J., Colomer, D., Pastor-Anglada, M. Leukemia 19:64-68, 2005

39 p= r = p= r = p= r = p= r = Equilibrative Nucleoside Transporter-2 (hENT2) Protein correlates with ex-vivo Sensitivity to Fludarabine in Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL)-cells. Molina-Arcas, M., Marcé, S., Villamor, N., Huber-Ruano, I., Casado, F.J., Bellosillo, B., Montserrat, E., Gil, J., Colomer, D., Pastor-Anglada, M. Leukemia 19:64-68, 2005 LA PROTEINA hENT2 COMO BIOMARCADOR DE LA RESPUESTA A LA FLUDARABINA EN ENFERMOS DE LLC

40 LA AUSENCIA DE hENT1 SE ASOCIA CON UNA MENOR SUPERVIVENCIA EN PACIENTES CON ADENOCARCINOMA PANCREÁTICO TRATADOS CON GEMCITABINA The absence of human equilibrative nucleoside transporter 1 is associated with reduced survival in patients with gemcitabine- treated pancreas adenocarcinoma Spratlin,J., Sangha, R., Glubrecht, D., Dabbagh, L., Young, J.D., Dumontet, C., Cass, C., Lai, R., Mackey, R.. Clinical Cancer Research 10: , 2004

41 1.-EL PATRÓN DE EXPRESION DE LAS PROTEÍNAS TRANSPORTADORAS CNT Y ENT PUEDE TENER RELEVANCIA DIAGNÓSTICA, AUNQUE ANTICIPAMOS QUE SERÁ VARIABLE EN FUNCIÓN DEL TIPO DE TUMOR. 2.-ES FUNDAMENTAL ANALIZAR ESTOS PATRONES DE EXPRESIÓN EN TUMORES SÓLIDOS DE ENFERMOS QUE ESTÉN BAJO UNA TERAPIA CON DERIVADOS DE NUCLEÓSIDOS. 3.-LA POSIBILIDAD DE REGULAR FARMACOLÓGICAMENTE LA FUNCIÓN DE ESTAS PROTEÍNAS TAMBIEN SE APUNTA COMO UNA APLICACIÓN TERAPÉUTICA COADYUVANTE, AL PODER EVENTUALMENTE MODULAR LA BIOASEQUIBILIDAD DE FÁRMACOS. CONCLUSIONES

42 MECANISMOS DE ACCIÓN DE LOS FÁRMACOS DERIVADOS DE NUCLEÓSIDOS ASPECTOS BÁSICOS DE LOS TRANSPORTADORES DE NUCLEÓSIDOS (NTs) FARMACOLOGÍA DE LOS NTs PATRONES DE EXPRESIÓN DE NTs E IMPLICACIONES CLÍNICAS ANÁLISIS FARMACOGENÓMICO DE LA ACCIÓN DE FÁRMACOS DERIVADOS DE NUCLEÓSIDOS

43 OBJETIVO Utilizar la técnica de microarrays de DNA para: Profundizar en las bases moleculares de la acción farmácológica de los análogos de nucleósidos Profundizar en las bases moleculares de la acción farmácológica de los análogos de nucleósidos Estudiar el papel de los transportadores de nucleósidos en la acción de los análogos de nucleósidos Estudiar el papel de los transportadores de nucleósidos en la acción de los análogos de nucleósidos Efecto del 5DFUR en células MCF7 (tumor de mama) Inhibición del transportador ENT1 con NBTI

44 Caracterización de la línea MCF7 Expresa los cinco transportadores de nucleósidos Expresa los cinco transportadores de nucleósidos Presenta únicamente transporte equilibrativo, principalmente ENT1 Presenta únicamente transporte equilibrativo, principalmente ENT1 5DFUR es transportado mayoritariamente a través de ENT1 5DFUR es transportado mayoritariamente a través de ENT1 Citotoxicidad de 5DFUR 90 minuto de tratamiento 90 minuto de tratamiento Medida por contaje celular Medida por contaje celular +/- NBTI 100nM +/- NBTI 100nM

45 CONDICIONES ELEGIDAS PARA LOS ESTUDIOS FARMACOGENÓMICOS 5-DFUR 250 M NBTI IC75 + NBTI IC50 5-DFUR 250 M NBTI IC75 + NBTI IC50 90 minutos de tratamiento 90 minutos de tratamiento +/- NBTI 100 nM (pre-incubación 30 min) +/- NBTI 100 nM (pre-incubación 30 min) Efecto a tiempos cortos 4h y a tiempos largos 24h Efecto a tiempos cortos 4h y a tiempos largos 24h 8 condiciones experimentales control control NBTI 100nM NBTI 100nM 5-DFUR 250 M 5-DFUR 250 M 5-DFUR 250 M + NBTI 100nM 5-DFUR 250 M + NBTI 100nM 4 y 24 horas postratamiento arrays 2 experimentos independientes 2 experimentos independientes marcaje Cy3 y Cy5 marcaje Cy3 y Cy5 32 arrays

46 4h 24h ctrlNBTI 5DFUR5DFUR+NBTI G0/G1- 41% S- 36% G2- 23% G0/G1- 42% S- 36% G2- 22% G0/G1- 51% S- 34% G2- 16% G0/G1- 52% S- 33% G2- 15% G0/G1- 54% S- 25% G2- 21% G0/G1- 50% S- 26% G2- 23% G0/G1- 42% S- 38% G2- 19% G0/G1- 53% S- 24% G2- 21% EFECTO DEL TRATAMIENTO CON 5DFUR Y DE LA INHIBICIÓN FARMACOLÓGICA DEL TRANSPORTADOR hENT1 SOBRE EL CICLO CELULAR

47 1- Obtención y amplificación de RNA 2- Síntesis y marcaje del cDNA 3 – Hibridación de los arrays (respecto a un control universal) 4- Scanning 5- Cuantificación de las señales de hibridación: Gene pix 6- Obtención de datos Descartar las columnas que no interesan. Nos quedamos (por ejemplo) con: - Flag - Bloque - Columna - Fila - Nombre - ID - Media F635 - Mediana B635 - Media F532 - Mediana B532 ANÁLISIS INFORMÁTICO ONCOCHIP-CNIO > SPOTS > GENES Role of hENT1 in fluropyrimidine-induced gene expression in breast cancer cells. Molina-Arcas, M., Moreno-Bueno, G., Hernández, H.L., Casado, F.J., Palacios, J., Pastor-Anglada, M., submitted

48 RT-PCR semicuantitativa Diseñar primers de los genes a validar - Análisis de homologia con isoformas de la misma familia - Control endógeno GAPDH (banda 175pb) Buscar para cada gen condiciones no saturantes 1,252, ºC min 94ºC s 55ºC s 72ºC s 72ºC min 30 ciclos Amplificación del gen de interés conjuntamente con el control endógeno (GAPDH) - + PLK2 RRM2B GAPDH Muy complicado amplificar el gen sin saturar la GAPDH Hacemos - cada gen por separado - cada condición por duplicado

49 PLK2 TP53I3 RRM2B AQP3 TP53INP1 GAPDH CTRLNBTI5DFUR5DFUR+NCTRLNBTI5DFUR5DFUR+N 4 horas 24 horas RT-PCR semicuantitativa

50 Real-time PCR: FAS y p21 Real-time PCR RNA Arrays RNA amplificado Hemos perdido información al amplificar el RNA?

51 4h 24h ctrlNBTI 5DFUR5DFUR+NBTI Immunocitoquímica: MDM2

52 Profundizar en las bases moleculares de la acción farmácológica de los análogos de nucleósidos - 90 minutos de tratamiento es un tiempo suficiente para ejercer una acción farmacológica - El tratamiento induce parada de ciclo en fase S - El mayor efecto se produce a las 24 horas después de 90 minutos de tratamiento. La mayoría de genes que se inducen son dependientes de p53 - El tratamiento con NBTI revierte el efecto sobre ciclo y la inducción de la mayoría de los genes - En realidad estas técnicas tan sólo son generadoras de hipótesis - Se demuestra imprescindible realizar análisis funcionales de las posibles dianas farmacológicas - El microchip se transforma en un listado discreto de genes. En nuestro caso los validaremos tanto analizando el efecto de otros fármacos como determinando el papel de funciones transportadoras concretas sobre su función

53 José García-Manteiga Sylvie Duflot Ivette Aymerich Javier Casado Sonia Fernández Veledo Míriam Molina Marçal Pastor-Anglada Elena Guillén-Gómez DEPARTMENT OF BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY UNIVERSITY OF BARCELONA REGULATION OF TRANSPORT SYSTEMS RESEARCH GROUP Pedro Cano-Soldado Isabel Huber Ruano FIS (Ministerio de Sanidad y Consumo), Plan Nacional en Biomedicina (Ministerio de Educación y Ciencia), Generalitat de Catalunya, Fundación Ramón Areces, FIPSE, Fundación la Caixa, Lilly, Roche Diagnostics, Balagué Center


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