QUIMIOTAXIS. Cómo se mueve E. coli : corridas + tumbos = exploración al azar CCW: CORRIDA CW: TUMBO.

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1 QUIMIOTAXIS

2 Cómo se mueve E. coli : corridas + tumbos = exploración al azar CCW: CORRIDA CW: TUMBO

3 Una exploración al azar sesgada permite seguir un gradiente Detección del gradiente: temporal (memoria ~3") alta sensibilidad Amplio rango Integración de estímulos amino ácidos azúcares Science, 1969, Julius Adler Las rtas quimiotácticas de E.coli A galactosa no requerían metabolismo

4 Placas de “swimming” Agar blando Atrayente metabolizable Gradiente generado por el consumo Movimiento coordinado siguiendo el gradiente serina aspartato

5 salvaje (Tar + Tsr + ) Ciega a aspartato (Tar - ) No quimiotáctica (Che - ) Anillo de serina Anillo de aspartato Ciega a serina (Tsr - ) No móvil (Fla -, Mot - ) Mutantes en genes de quimiotaxis tryptone, 32°C, 8 hr.

6 pCS12 (wt Tsr) pCS12 R388ApCS12 R388A* Placas de swimming: método óptimo para aislamiento de mutantes

7 Método en capilares

8 Ensayo del tapón de agarosa

9 Sistema de señalización relativamente simple Notable conservación en las proteínas de señalización Capacidad de detectar gradientes químicos con exquisita sensibilidad Capacidad de detectar gradiente en un amplio rango de concentraciones Integración y amplificación de señales

10 W A Y Y P Los niveles de CheY-P determinan cierta frecuencia de cambios de dirección

11 W A Y Los atrayentes inhiben la kinasa, REDUCIENDO la frecuencia de cambios de dirección

12 ADAPTACION Regreso a la frecuencia de cambios inicial (antes del estímulo). Permite a la bacteria la detección de cambios de concentración en un rango de 5 órdenes de magnitud. Mediada por la metilación reversible de los receptores. Provee a la célula de una especie de memoria. EXCITACION Cambio en la actividad de la kinasa (y por lo tanto en la frecuencia de cambios) en respuesta a un gradiente de atrayente o repelente

13 MCPs: Methyl-accepting Chemotaxis Proteins Tsr: serina Tar: aspartato y maltosa (MBP) Tap: dipéptidos Trg: ribosa (RBP) y galactosa (GalBP) Aer: O 2 (estado redox?) Aer

14 Vía de transducción de señales involucrada

15 Los quimiorreceptores se agrupan en los polos de la célula Maddock & Shapiro, 1993 Sourjik & Berg, 2000 Zhang, et al., 2007

16 WW A Tar Tsr Existen interacciones laterales entre distintos receptores?

17 Briegel et al 2012

18 Estructura de MCPs Dominio citoplasmático de Tsr

19 Características espectrales de las proteínas fluorescentes spectral overlap between CFP and YFP CFP emission YFP excitation

20 Sourjik & Berg, 2002 Figuras de Sourjik, 2004 Ensayo FRET in vivo para la actividad kinasa de CheA

21 Detección de FRET CheZ-CFP/CheY-YFP figure from Sourjik et al., 2007 Sourjik & Berg, 2002

22 CheY-YFP + CheZ-CFP Estas dos proteínas interactúan cuando CheY está fosforilada, por lo que el cambio en la fluorescencia relativa es una medida casi directa de la actividad de la kinasa CheA

23 Organización de los genes en E. coli Tar cheW cheZcheY cheA cheRcheB Tap motAmotB Flagellin exp. App. E. coli chemotaxis operon Vibrio cholerae: más de 50 MCPs Pseudomonas putida: 27 MCPs, 4 cheAs Rhodobacter sphaeroides: 13 MCPs Geobacter sulfurreducens: 34 MCPs, 6 cheAs

24 Scharf et al, 2016

25 Wuichet et al, 2010

26 Alexander y Zhulin, 2007 Alineam.

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28 Swimming Con fenantreno Based on a 16S rDNA PCR fragment sequence: Halomonas sp. KHS3 Receptor específico de Hidrocarburos??

29 Flagellar Biosynth esis prot 922 MotA 933 CheA 931 MCP 929 CheR 927 MCP 925 CheZ 923 MotB 932 CheW 930 MCP 928 CheY 924 928 CheB 926 Hypothetical protein (GGDEF) MCP 864 (40H) CheB 865 Similarity To glutathyonil … CheR 866 CheA/Y 867 CheY 868 CheW 870 Cluster 1 Cluster 2 (Canonical) (non-canonical) Sistema de quimiotaxis de Halomonas sp KHS3 - 24 MCPs Ligandos??

30 Identificación de ligandos Estudios in vitro utilizando el dominio periplasmático purificado ITC: isothermal titration calorimetry (titulación calorimétrica isotérmica) A medida que continuan las inyecciones, el target se va saturando con ligando, cada vez hay menos unión por lo que el cambio de temperatura comienza a disminuir Cuando la macromolécula está saturada de ligando, no se producen más uniones. Solo se observa calor debido a la dilución. Medida directa del calor generado o absorbido cuando las moléculas interactúan.

31 TSA: Thermal Shift assays (ensayos de cambio de temperatura de desnaturalización) El ligando interactúa con la proteína, estabilizándola, variando su Tm. Es un método de screening rápido y económico que permite identificar ligandos que se unen y estabilizan proteínas purificadas. Esta técnica se lleva a cabo utilizando un instrumento de Real Time PCR La temperatura de desnaturalización se mide mediante el incremento de la fluorescencia de un fluoróforo que tiene afinidad por las partes hidrofóbicas de la proteína, que se exponen a medida que la proteína se despliega. Esto permite calcular la temperatura de melting (Tm). Niesen, 2007 Permite un aumento gradual de la temperatura, midiendo florescencia en cada punto de la curva.

32 Mediante ensayos in vivo (mutantes nulas ) determinan que McpU media quimiotaxis a exudado de raíz. Uno de los principales componentes es la prolina. Por homología de estructura identifican el sitio de unión a ligando del receptor FIG 8 ITC of McpU-PR and McpU-PR D182E with proline. Titration of McpU-PR (A) and McpU- PR D182E (B) was carried out at a protein concentration of 812 µM with 10-µl injections of 9.8 mM proline. Reference data were produced by titrating buffer with proline and subtracting the resulting heat of ligand dilution from the experimental curves shown. Upper panels show the raw titration data, and lower panels show the normalized and dilution corrected peak areas of the raw titration data. The data were fitted with the One-Set-of-Sites model of the MicroCal version of Origin7. DSF ITC

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35 TMEA Tris-(2-maleimidoethyl) amine Tsr S366C O-O distance: 10.4 Å S366C (Tsr) es un buen indicador de la formación de trímeros (a través de crosslinking con TMEA)

36 Ensayo de crosslinking para detectar trímeros de dímeros in vivo

37 Modelo para la formación del complejo de receptores Trímeros de dímeros: tienen un papel esencial en la señalización?

38 Piston & Kremers, 2007 Green fluorescent protein (GFP)