TEMA 19- ESTRATEGIAS DE CONTROL DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA II.

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1 TEMA 19- ESTRATEGIAS DE CONTROL DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA II.
Introducción regulación por Cambios Conformacionales. 2. Interacción proteína-ligando. 2.1. Función de Scatchard. Linearización de la ecuación de Scatchard. 2.2. Ecuación de Hill. Linearización de la ecuación de Hill. Razón de saturación Rs. 3.Modelo Proteínas alostéricas. 3.1.Modelo concertado de Monod, Wyman y Changeux (MWC) Enzimas alostéricas tipo K Enzimas alostéricas tipo V Modelo alostérico mixto 3.2. Modelo secuencial (KNF).

2 iii) Significado biológico/bioquímico de este tipo de control.
Regulación por Cambios Conformacionales - Observaciones experimentales i) Observaciones experimentales que condujeron al desarrollo de la idea sobre los cambios conformacionales y su papel en la regulación de la actividad enzimática. ii) Modelos teóricos empleados para la descripción de este sistema de control. iii) Significado biológico/bioquímico de este tipo de control. - Modelo de Monod-Wyman-Changeux - Modelo de Koshland-Nemethy-Filmer

3 Threonine dehydratase
I) Observaciones experimentales * Muchas de las ideas sobre el control conformacional de la actividad enzimática se desarrollaron como consecuencia del trabajo sobre las vías biosintéticas de los aminoácidos en microorganismos, especialmente en E. coli. * A mediados de la década de los años 50 se descubrió que la Treonina-dehidratasa, primera enzima de la vía biosintética de la Ile, en E. coli, se inhibía fuertemente por Ile, producto final de la vía, que tiene muy pocas analogías estructurales con el sustrato de la enzima, la Thr. Threonine dehydratase L-Thr > 2-Oxo-butyric acid ---> ---> ---> > ---> L-Ile - - Sólo la primera enzima de la vía, la “treonina-dehidratasa”, muestra este tipo de inhibición.

4 * Un ejemplo, semejante, se encontró en el caso de la enzima Carbamoiltransferasa o Aspartato Transcarbamilasa (ATCasa), enzima que cataliza la primera reacción de la vía biosintética de las bases pirimidínicas, en E. coli, la cual se inhibe también por el producto final de la vía, especialmente por CTP.

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6 + COO- CH2 HN-C-COO- H H - O H2N-C- = COO- CH2 N-C-COO- H H - O
Active relaxed form Carbamoyl phosphate Aspartate Carbamoyl aspartate COO- CH2 HN-C-COO- H H - O H2N-C- = COO- CH2 N-C-COO- H H - O H2N-C-O-PO32- = + ATCase ATP Quaternary structure CTP Nucleic acid metabolism Feedback inhibition CCC Catalytic subunits CTP R R R Regulatory subunits CCC Catalytic subunits Inactive tense form

7 * En este caso, también se observó que el ATP podía actuar activando a la enzima, la ATCasa; proporcionando así un mecanismo para conseguir el balance entre la producción de nucleótidos purínicos y pirimidínicos, necesarios para la biosíntesis de ácidos nucleicos. * A principios de los años 60, ya se habían descrito varios sistemas que presentaban este tipo de regulación, en los que únicamente la primera enzima de la vía era inhibida por “retroalimentación” o “feed-back”. * El primer intento serio de unificar todas estas observaciones fue realizado por Monod, Changeux y Jacob, y constituye uno de los trabajos “clásico” de la Enzimología. - Monod, Changeux and Jacob (1963). J. Mol. Biol. 6, 306

8 - En este trabajo se resaltan los siguientes puntos o características comunes a este tipo de sistemas: a) El ligando implicado en la regulación de la actividad enzimática (molécula reguladora o efector), generalmente, es estructuralmente diferente del sustrato o el producto de la reacción que cataliza la enzima retroinhibida. b) La mayor parte de las enzimas cuya actividad se controla/regula por este tipo de regulación, no muestran cinéticas hiperbólicas clásicas cuando se representa v  [S], sino que muestran una cinética de tipo sigmoidal.

9 c) Es relativamente fácil distinguir entre la unión del efector a la enzima y la unión del sustrato. Varios tratamientos químicos y físicos nos permiten “desensitizar” la enzima, es decir, hacerle perder su respuesta ante las moléculas reguladoras o efectores sin que ello lleve parejo la perdida de la actividad catalítica. Así en el caso de la ACTasa un tratamiento térmico, suave, da lugar a una enzima activa no inhibible por CTP. La enzima “desensitizada” muestra una cinética hiperbólica semejante a la que presentan las enzimas michaelianas. d) Generalmente las enzimas que se regulan por este mecanismo son “oligómeros”, es decir, proteínas formadas por varias subunidades iguales o distintas, unidas entre si por fuerzas débiles.

10 * Monod, Changeux y Jacob propusieron que la molécula reguladora o efector se une a un sitio de la enzima diferente del centro activo, de manera que la interacción entre la molécula reguladora y el sustrato tiene lugar de manera indirecta o “alostérica”, (del griego otra estructura). * La unión de la molécula reguladora al “sitio de regulación” induce un cambio conformacional reversible en la enzima que causa una alteración de la estructura del centro activo y los consiguientes cambios en sus propiedades cinéticas.

11 - + Sitio regulador Centro activo

12 2. INTERACCIÓN PROTEÍNA-LIGANDO
Una proteína une más de una molécula de un mismo ligando L L L L L P P P P P L L L K K K K4 L L L K1 < K2< K3< K4 Cooperatividad positiva K1> K2> K3> K4 Cooperatividad negativa K1 = K2 = K3 = K4 No cooperatividad Tratamiento de Scatchard permite calcular el número de sitios de unión por molécula de proteína, la constante de unión proteína-ligando y el tipo de cooperatividad

13 2.1. FUNCION DE SCATCHARD La función de Scatchard, , se define como la razón entre la concentración de ligando-unido y la concentración total de proteína [Ligandounido}  = [Proteína] - Esta función es diferente de la función de saturación, que representa el número de sitios ocupados partido por el número total de sitios de unión que tiene la macromolécula. Nº Sitiosocupados Y = Nº totalsitios

14 Se deduce la relación función de Scatchard y Saturación
Nº sitios = (concentración de proteína) x (numero de sitios por mol de proteína) No total sitios = [P] n Se deduce la relación función de Scatchard y Saturación  = Y n En esta ec.  --> función de Scatchard Y --> función de saturación L P L n --> nº sitios por mol de proteína Para deducir la ecuación de Scatchard consideraremos una proteína P, con dos sitios de unión para el mismo ligando, L, que se unen independientemente y con la misma afinidad a ambos sitios.

15 En el sistema no existe cooperatividad,  K1 = K2 = K3 = K4=K
[Ligandounido}  = [Proteína]

16 K[L]  = 2 ----------------- 1 + K[L]
La función de Scatchard para dos lugares equivalentes viene definida por: Deducción Enzimología. Página 224 Nuñez de Castro 2001 K[L]  = K[L] Para un número n de lugares equivalentes de unión K[L]  = n K[L] n número de ligandos que pueden unirse por molécula de proteína K es la constante de equilibrio de unión del ligando a cada centro (es la misma para todos los lugares de unión n que tenga la proteína [L] es la concentración de ligando libre

17 K[L]  = n ----------------- 1 + K[L]
Linearización de la ecuación de SCATCHARD K[L]  = n K[L] Dividendo por [L] y despejando  [L] = nK - K 

18 Representación de Scatchard para una proteína que tiene 4 lugares de unión equivalentes
m = - K  [L] mM-1 n No cooperatividad PERMITE CALCULAR NÚMERO DE LIGANDOS QUE SE UNEN POR MOLÉCULA DE PROTEÍNA K es la constante de equilibrio de cada uno de los sitios de unión

19  [L]  Cuando las gráficas se desvían de la linealidad
Linearización de la ecuación de SCATCHARD Cuando las gráficas se desvían de la linealidad Proteínas presentan cooperatividad Cooperatividad positiva  [L] mM-1 n Cooperatividad negativa  Cálculo: EQUILIBRIO DE DIÁLISIS, CENTRIFUGACIÓN

20 Y = ------------------ 1 + K [Po2]nh
2.2. TRATAMIENTO DE HILL Enzimas presentaban cinéticas de saturación respecto al substrato se desviaba del comportamiento hiperbólico michaeliano Semejanza Cinética sigmoidal Curva de saturación de la hemoglobina K [Po2]nh Y = 1 + K [Po2]nh Y es saturación Po2 presión parcial de oxigeno K constante de formación del complejo oxihemoglobina K` = [Po2]nh0.5 [Po2]0.5 Presión da una saturación de 0,5 nh índice de Hill valor experimental (hemoglobina 2,8) [Po2]nh Y = K` + [Po2]nh

21 Snh Y = ------------- Snh0,5 + Snh S S = -----------
Tratamiento de Hill Aplicada a las enzimas con cinética sigmoidal v Y = Vmax Saturación de la enzima [Po2]nh Y = K` + [Po2]nh Snh Y = Snh0,5 + Snh S0,5 Concentración substrato la saturación es igual ½ Vmax nh igual a 1 es una saturación hiperbólica michaeliana S0,5 = Km S Y = = S0,5 + S S = Km + S v Vmax nh>1 Cooperatividad positiva nh<1 Cooperatividad negativa

22 vo nh<1 nh>1 nh=1 S nh>1 nh<1 nh=1 1/vo 1/S 1/S 1/S
Vmax Snh vo = Snh0,5 + Snh nh>1 nh=1 S nh>1 nh<1 nh=1 1/vo 1/S 1/S 1/S

23 2.2.1-Linearización de la ecuación de Hill
Reacción enzimática la fracción de saturación Representando la ecuación lineal

24 La ecuación de una recta pendiente es el índice de Hill
log [S] Log[S0,5] m = nh Obtención valor experimental del índice de Hill Deducir la existencia de cooperatividad Valor de S0,5 S0,5 Concentración substrato para la cual la saturación es igual a ½ de la velocidad máxima

25 Enzima michaelianas es constante e independiente de Km y Vmax S 0,9
Razón de saturación Rs. Significado biológico de la cooperatividad positiva y negativa. Rs, la razón de las concentraciones de substrato que dan como resultado el 10% y 90% de saturación Enzima michaelianas es constante e independiente de Km y Vmax S 0,9 Rs = S 0,1 Snh 0,9 Y = 0,9= Snh 0,5 + Snh 0,9 0,1 Snh 0,9 0,9 Snh 0,1 0,9 Snh 0,5 = 0,1 Snh 0,9 9 = Snh 0,1 Y = 0,1= Snh 0,5 + Snh 0,1 S 0,9 Rs = = S 0,1 0,1 Snh 0,5 = 0,9 Snh 0,1

26 nh = 1,0 valor de Rs es igual a 81 No cooperatividad
nh = 2,0 el valor de Rs es igual a 9,0 Cooperatividad positiva nh = 0,5 el valor de Rs es igual a Cooperatividad negativa Enzimas con cooperatividad positiva, un cambio en la concentración de sustrato de 9 veces hace que la enzima pase de una saturación del 10% al 90% Interruptores metabólicos Enzimas con cinética hiperbólica, índice de Hill 1 se necesita aumentar 81 veces Enzimas con cooperatividad negativa, para que la enzima pase de una saturación del 10% al 90% se necesita aumentar 6561 veces. Amortiguadores de las variaciones de la [S]. Ej fosfatasa alcalina de E.coli suministra fosfato inorgánico.

27 3.MODELOS PROTEÍNAS ALOSTÉRICAS.
Proteína alostéricas actividad esta regulada por la unión no covalente y reversible de moduladores: Se unen a sitios distintos al sustrato Transición alostérica hace referencia a transducción de una señal a un lugar diferente ocupado por esa señal en la proteína. Efecto alostérico: Cambios conformacionales en una enzima dan lugar a aumento o inhibición de la actividad Transición alostérica homotrópica cuando induce cambios en la unión del mismo tipo de ligando Transición alostérica heterotrópica cuando induce cambios en la unión del otro tipo de ligando Hill no era posible determinar con exactitud las constantes de disociación y las constantes alostéricas

28 Relajada, alta afinidad
3.1. Modelo concertado de Monod, Wyman y Changeaux 1. Las proteínas alostéricas son proteínas oligoméricas 2. Las subunidades (protomeros) ocupan posiciones equivalentes, de manera que dentro del oligómero, existe al menos un eje de simetria. 3. Cada protomero posee un sitio de unión (solo uno) para cada uno de los diferentes ligandos: Activadores o inhibidores 3. El oligómero puede existir en dos estados conformacionales, que designaremos por R (relajada, alta afinidad) y T (tensa, baja afinidad) y que presentan afinidad diferente por un ligando dado. R T Relajada, alta afinidad Tensa, baja afinidad

29 Relajada, alta afinidad
4. La conformación de la proteína cambia de de la forma R a la forma T (o viceversa) se conserva la simetría del oligómero. Los cambios R T son concertados, no hay formas híbridas, compuestas por subunidades (R-T) * Si representamos la conformación de las subunidades en forma T y R por un circulo y un cuadrado respectivamente, existe el siguiente equilibrio: T R Tensa, baja afinidad Relajada, alta afinidad

30 5. No existirán especies híbridas (TR) ya que en tal caso se perdería la simetría del oligómero.
*En otras palabras, todas las subunidades cambian de conformación de una manera “concertada”, lo que le ha dado también nombre al modelo: Modelo concertado. 6. Las formas R y T pueden poseer diferente capacidad catalítica (siendo kcR y kcT las constantes catalíticas de las formas R y T, respectivamente) o diferentes afinidades por los ligandos sustratos, activadores o inhibidores. KR y KT constantes de disociación intrínsecas de cada uno de los protómeros de las formas R y T y el Substrato. * En la siguiente figura, se representa el modelo concertado más sencillo de una proteína dimérica que tiene un activador A, y un inhibidor I:

31 L cte de equilibrio entre las dos formas R y T.
[T] L = [R] L cte de equilibrio entre las dos formas R y T. Saturación por ligando 0.0 0.5 1.0 KT KR Cálculo de Y Enzimología. Nuñez de Castro Pg 237 S S KR KT S S P S S P kcR kcT

32 L cte de equilibrio entre las dos formas R y T en ausencia de ligando.
Parámetros describen el estado de un sistema alostérico Y La función de saturación, la hemos definido anteriormente como la razón entre el número de sitios ocupados partido por el número total de sitios. Y= v/Vmax L cte de equilibrio entre las dos formas R y T en ausencia de ligando. [T] L = [R] n número de sitios de unión c constante ratio de las dos constantes de disociación KR c = KT  Concentración de ligando libre [S]  = KR L c  (1+ c  )n-1 +  (1 +  )n-1 Y = L (1+ c  )n + (1 +  )n-1

33 R T 3.1.1.Enzimas alostéricas modelo tipo K Tensa Relajada
Misma constante catalítica kcR = kcT R mayor afinidad por el sustrato KR <<<KT KR c = KT C O L c  (1+ c  )n-1 +  (1 +  )n-1 Y = L (1+ c  )n + (1 +  )n  (1 +  )n-1 Y = L + (1 +  )n 1 Y Ecuación sigmoidal 

34 Velocidad máxima no se ve alterada
Y = L + (1 +  )n Y L= 0 L= 10 L = 100 L =1000 L = 0 No hay equilibrio de transconformación (Todo esta como R) la ecuación queda reducida a Ec. M-M  Y = (1 +  )  Velocidad máxima no se ve alterada La presencia del ligando afecta la afinidad del enzima por el sustrato Modifica la Km Cambia la concentración de substrato para la cual la saturación es semimáxima Inhibidor desplaza el equilibrio hacia la forma T (KR <<<KT) Km Activador desplaza el equilibrio hacia la forma R Km

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41 R T Enzimas alostéricas modelo tipo V
Tensa Relajada Diferente constante catalítica kcR = kcT Igual afinidad por el sustrato KR = KT KR c = KT C L c  (1+ c  )n-1 +  (1 +  )n-1 Y = L (1+ c  )n + (1 +  )n  Y = 1 +  Saturación hiperbólica Acción de los moduladores (activadores e inhibidores) sobre la Vmax

42 Fosforilasa b activada por AMP
Vmax = kcR R + kcT T Suma de la contribución a la velocidad de la forma transconformada R y de la forma transconformada T A VmaxA vo Vmax Vmax I I Km S Fosforilasa b activada por AMP Aspartato quinasa (EC ) de E.coli inhibe por lisina

43 3.1.3.Enzimas alostéricas modelo tipo K mixto
Tanto la constante catalítica como la afinidad (Km) cambian Resumen modelo MWC - Sencillo Modelo da cuenta del comportamiento de proteínas que muestran cinética sigmoide y que son oligomericas. Se adecua a la acción de activadores e inhibidores alostéricos Limitación No explica el compartamiento cinético de aquellas proteínas que tienen cooperatividad negativa. NOTA: Cinética sigmoide no es sinónimo de alosterismo. Hay proteínas con cinética sigmoide no alestericas y enzimas alostericas con cinética hiperbólica (enzimas alostéricas tipo V puro)

44 3.2.Modelo secuencial de Koshland, Nemethy y Filmer
Ligando unido a uno de los protomeros induce un cambio conformacional Ajuste inducido de Kosland + Cooperatividad positiva Entrada de un segundo ligando - Cooperatividad negativa Permite la presencia de formas híbridas, (prohibido en el modelo concertado) 2. Explica tanto la cooperatividad positiva como negativa 3. Modelo concertado , sería un caso particular del modelo secuencial, en el que se explica únicamente la cooperatividad positiva.

45 RESUMEN TRATAMIENTO DE SCATCHARD
El tratamiento de Scatchard permite el estudio de la unión de una proteína con varios ligandos. La representación linealizada de la ecuación permite obtener el número de ligando que se unen por mol de proteína, así como la afinidad de los lugares de unión. El signo de la cooperatividad se puede obtener de la representación linealizada ECUACIÓN DE HILL Derivada del estudio de la saturación de la hemoglobina es útil para explicar la saturación no hiperbólica que se da en enzimas que se desvían del comportamiento Michaeliano, monstrando curvas sigmoidales, con cooperatividad positiva, o hipérbolas no equiláteras (curvas de cooperatividad negativa). El índice de Hill (nh) es un parámetro experimental y no tiene que ser un número entero. RAZON DE SATURACIÓN La razón de saturación (Rs) entre concentraciones de substrato para dar una saturación del 90% a una concentración de substrato para la obtención de una saturación del 10% es 81, en el caso de las proteínas con cinéticas michaelianas; es mucho menor para proteínas con cooperatividad positiva, y muchísimo mayor para proteínas con cooperatividad negativa. Enzimas con cooperatividad positiva puede comportarse como un interruptor metabólico; por otra parte, una proteína con cooperatividad negativa puede servir para mantener el mismo flujo a pesar de las posibles variaciones en la concentración de substratos.

46 MODELO ALOSTÉRICO CONCERTADO
Modelo propuesto por Monod, Wyman y Changuex. Explica de forma clara y elegante la mayor tipo de procesos alostéricos de regulación. Esquema mecánico simple, proteínas oligoméricas, con ejes de simetria Clasifica en tres tipos de enzimas alostéricas. Tipo K, son proteínas oligoméricas que presentan cooperatividad positiva, asi como la acción de inhibidores y activadores. Tipo V explica igualmente la acción de activadores e inhibidores sobre la velocidad máxima sin cambiar la constante de afinidad por el substrato. Tipo mixto, una mezcla de ambos modelos. MODELO ALOSTÉRICO CONCERTADO Modelo más potente , tiene mayor complejidad , no es muy utilizado en Enzimología . Práctica el instrumento más utilizado es el índice de Hill