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CINÉTICA ENZIMÁTICA E + S SE E + P Proteínas con actividad catalítica de los seres vivos. Unidades del Metabolismo Regulan la vel. de las reac. quím.

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2 CINÉTICA ENZIMÁTICA

3 E + S SE E + P

4 Proteínas con actividad catalítica de los seres vivos. Unidades del Metabolismo Regulan la vel. de las reac. quím. espontáneas ( G-). No promueven reacciones no-espontáneas ( G +). Incrementan la Vel. De reacción 10 3 a veces sin afectar el sentido de la reacción. No forman parte del producto de la reacción.

5 PROPIEDADES GENERALES AUMENTAN LA VELOCIDAD DE REACCIÓN –De 10 6 to veces vs sin enzima. –Aún más rápido que los catalizadores químicos. CONDICIONES DE REACCIÓN –Temperatura o C (algunas hasta 75 o C) –pH neutro (5-9), la mayoría 6.5 – 7.5 –Presión atmosférica normal CAPACIDAD DE REGULACIÓN –Por concentración de sustrato –Por concentración de enzima –Por inhibidores competitivos (semejantes al sustrato) –Por inhibidores no competitivos (modificación covalente de la enzima) –Por regulación alostérica ALTA ESPECIFICIDAD DE REACCIÓN –Interacción estereoespecífica con el sustrato –No hay productos colaterales

6 ALTA ESPECIFICIDAD DE REACCIÓN INTERACCIÓN ESTEREO ESPECÍFICA CON SU SUSTRATO

7 Los Substratos se acercan a la Enzima (sitio Activo) Enzima Substratos HO- H-

8 Los reactivos interaccionan con la enzima (sitio activo)

9 Cambia la configuración de la enzima

10 La unión del sustrato produce un cambio conformacional de la enzima hexoquinasa (cinasa), la cual es monomérica. Substrato de glucosa Sitio de enlace

11 Se realiza la reacción catalítica

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14 Leonor Michelis y Maud Menten (1913) Tiempo Concent.

15 ECUACIÓN DE MICHAELIS-MENTEN V o = V max [S] K m + [S]

16 Cinética enzimática en función de la concentración de sustrato

17 V max KMKM

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19 Catalasa H 2 O Hexoquinasa ATP 0.4 D-Glucosa 0.05 D-Fructosa 1.5 Anhidrasa carbónicoa HCO Quimotripsina Gliciltirosinilglicina108.0 N-Benzoiltirosinamida 2.5 -Galactosidasa D-Lactosa 4.0 Treonina deshidrogenasaL-Treonina 5.0 K m de algunas enzimas ENZIMA SUSTRATO K m (mM)

20 La K M es un parámetro de Actividad Enzimática La K M es inversamente proporcional con la actividad de la enzima. Valor de K M grande, baja actividad Valor de K M pequeño, alta activida

21 ATP + Glucosa ADP + 6-fosfato de glucosa 2 Rutas Enzimas: pueden catalizar reacciones donde hay 2 S = Hexocinasa Desplazamiento Simple, los 2 S se unen a la E A + B + E EAB C + D Doble desplazamiento o ping-pong A + B + E AE BE + C D

22 Determinación Cuantitativa de la Cinética Enzimática 1.La reacción global 2.Procedimeinto analítico para determinar elS que desaparece o el P que aparece 3.Sí el E requiere Cofactores (iónes o coenzimas) 4.La dependencia de la actividad enzimática con la [S] o se la K M del S. 5.El pH óptimo 6.Un intervalo de temperatura en la que la E es estable y muestra actividad elevada.

23 Actividad enzimática y variación del pH

24 pH Vo Pepsina1.5 Tripsina7.7 Catalasa7.6 Arginasa9.7 Fumarasa7.8 Ribonucleasa7.8 Enzima pH óptimo Temperatura o C) Vo Coenzima Vo Tiempo (min) Vo

25 1.0 Unidad de Actividad Enzimática (U): La cantidad que transforma 1.0 mol (10-6 M) de S /min, a 25 0 C, en las condiciones de medida óptima. Actividad específica: Es el no. de U de una E / mg de proteína. Es decir: una medida de la pureza de la E. Al purificarla, el valor llega a un máximo y es estable. Número de recambio No. de moléculas de S transformadas /unidad de tiempo, por una molécula de E ( o por un solo sitio catalítico) Enzima No. de Recambio Anhidrasa carbónica B-Amilasa B-Galactosidasa Fosfoglucomutasa 1 240

26 ¿V max ? ¿K M ?

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30 pendiente Transformación de los Dobles Recíprocos (Lineweaver-Burk)

31 Gráfica de Eadie-Hofstee Vo [S] V max K M Vo V max

32 Cuando: V o = V max Todos los sitios activos están ocupados y no hay moléculas de E libre. K M = [S] Sí... ½ V max K M representa la cantidad de sustrato necesaria para fijarse a la mitad de la E disponible y producir la mitad de la V max K M representa la concentración del sustrato en una célula

33 Inhibidores Reactivos químicos específicos que pueden inhibir a la mayor parte de las enzimas. INHIBIDORES Irreversibles Reversibles

34 Inhibidor Irreversible Inhibición permanente Unión irreversible por medio de enlaces covalentes. Modificaciones químicas de los gps. catalíticos. Modificada la enzima, está siempre inhibida. Para distinguirlo de los reversible se someten a diálisis y si no se separan enzima e inhibidor, éste es permanente.

35 Inhibidor Irreversible Fluorofosfato de diisopropilo (DFP) Acetilcolinesterasa Acetilcolina Acetato + Colina Fluorofosfato de diisopropilo (DFP)

36 Inhibidor Irreversible Malatión Acetilcolinesterasa Tripsina Elastasa Fosfoglucomutasa Cocoonasa (larvas de gusanos de seda Fluorofosfato de diisopropilo (DFP)

37 Serina Iodoacetamida Cisteína Histidina

38 La unión del inhibidor y la enzima es reversible. Al quitar el inhibidor del medio, se recupera la actividad. Hay 3 tipos: Competitiva No Competitiva Acompetitiva (Alostérica) Inhibidor Reversible

39 Antibióticos Insecticidas Hervicidas Venenos Diferentes Medicamentos Dolor Inflamación Infecciones virales Cáncer Inhibición enzimática

40 Inhibición Competitiva

41 V max igual K M diferente

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43 Malonato Deshidrogenasa del ácido succínico SulfasInfecciones microbianas Antihipertensores: Captopril y Enalopril Alopurinol Controla la gota FluoruraciloCáncer Inhibidores Competitivos

44 El inhibidor NO se une al sitio activo Inhibición No Competitiva NO se puede revertir con un exceso de sustrato

45 V max diferente K M igual

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47 Cinéticas de Inhibición Competitivo V max igual K M diferente No competitivo V max diferente K M igual No inhibitor 1 V 1/[S] 0

48 Inhibición acompetitiva I El inhibidor se une a una SUBUNIDAD reguladora La subunidad catalítica une al sustrato y cataliza la reacción

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