Tema 9. Genética reversa IV. Construcciones antisentido. Diseño de construcciones antisentido. Detección de la presencia y efecto de la construcción AS.

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1 Tema 9. Genética reversa IV. Construcciones antisentido. Diseño de construcciones antisentido. Detección de la presencia y efecto de la construcción AS. Análisis de la actividad génica. RNAi. Silenciamiento.

2 Genética reversa IV. Construcciones antisentido. Estrategia: Eliminación de una actividad génica mediante la expresión, vía transgénesis, de un RNA antisentido Construcciones: Son fusiones transcripcionales en las que la secuencia de cDNA se integra en posición invertida El efecto es dependiente de la secuencia No es necesario incluir todo el cDNA en la construcción

3 Genética reversa IV. Construcciones antisentido. Flexibilidad: Inactivación de miembros específicos o de toda una familia de genes (redundancia) S. J. Temple, Suman Bagga and Champa SenguptaGopalan (1998) Downregulation of specific members of the glutamine synthetase gene family in alfalfa by antisense RNA technology. Plant Molecular Biology 37: 535–547. Distintos alelos en distintos eventos de transformación Dominante

4 Genética reversa IV. Construcciones antisentido. Métodos de análisis: Presencia de la construcción Nivel de transcripción Acumulación de proteína Problemas: El mecanismo de acción es poco claro, resultado impredecible Análisis Genético difícil si se da inestabilidad

5 Genética reversa IV. Construcciones antisentido. Hacia un modelo La elaboración de un modelo para explicar el efecto de las construcciones AS se ha visto facilitada por la observación de la conexiones existentes entre tres fenómenos: El silenciamiento mediado por sobre-expresión Los mecanismos de defensa frente a RNA exógeno El silenciamiento mediado por RNA duplexo

6 Genética reversa IV. Construcciones antisentido. El silenciamiento mediado por sobre-expresión Intentos de sobre-expresión de un gen da lugar a veces al silenciamiento del transgén+endógeno (co-supresión) Plant gene silencing regularized G. Bruening (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95,13349–13351

7 Genética reversa IV. Construcciones antisentido. En algunos casos el silenciamiento se ha correlacionado con el nivel de expresión del transgén El silenciamiento puede ser inducido por expresión transitoria El silenciamiento puede transmitirse por multiplicación vegetativa e injerto Como el AS el fenómeno es impredecible entre generaciones

8 Genética reversa IV. Construcciones antisentido. Mecanismos de defensa frente a RNA exógeno En la resistencia derivada del patógeno, un mecanismo de defensa natural es el silenciamiento La sobre-expresión de un fragmento del genoma viral confiere resistencia No es necesaria traducción, resistencia mediada por RNA Resistencia elevada y altamente específica La resistencia se mantiene incluso en protoplastos pero, como en el silenciamiento, no es predecible tras la meiosis y formación de semillas AS, silenciamiento y resistencia mediada por RNA operan a través de un mecanismo de PTGS que implica RNA duplex Virus resistance and gene silencing in plants can be induced by simultaneous expression of sense and antisense RNA (1998) P. M. WATERHOUSE, M. W. GRAHAM, AND M-B. WANG. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95,13959–13964 Virus resistance and gene silencing: killing the messenger (1999) P. M. Waterhouse, N. A. Smith and M-B. Wang. Trends in Plant Sciences 4, 452-457

9 Genética reversa IV. Construcciones antisentido. Silenciamiento mediado por RNA duplexo En C. Elegans, la inyección de un RNA duplex en la línea germinal provoca pérdida, heredable, de función del gen correspondiente El método explota la existencia de mecanismos de regulación de la expresión génica, posiblemente ancestrales, mediados por pequeños RNA duplex y operativos en el desarrollo El método es tan eficaz que se esta utilizando en la inactivación sistemática de todos los genes del gusano RNA interference: Its a small RNA world (2001) E. G. Moss. Current Biology 11 Genome-wide RNAi (2001) R. Barstead Current Opinion in Chemical Biology 5, 63–66

10 Un modelo para el PTGS Silencing genes silencing genes (2000) S. N. Covey. Trends in Plant Science 5, 405-406 RNA silencing in plants (2004) David Baulcombe. Nature, 431, 356-363. El problema está siendo diseccionado genéticamente en organismos modelo como C. Elegans, Drosophila, Arabidopsis o Neurospora POSTER

11 Un modelo para el PTGS Dicers at RISC: The Mechanism of RNAi. Previews Cell, Vol. 117, 1–4, April 2, 2004, En Drosophila se han encontrado dos genes DICER que parecen especializados en el procesamiento de miRNA y siRNA, respectivamente, y de la carga de los correspondientes RNA monohebra en los RISC (RNA-induced silencing complex)

12 Un modelo para el PTGS RNAi: RISC Gets Loaded. Preview. Cell, Vol. 123, 543–553, November 18, 2005 La formación de RISC loading complex (RLC) y la activación de los correspondientes RISC esta mediada por proteínas de la familia Argonauta, que son también responsables del corte o desnaturalización de los RNA duplex o microRNAs hairpins

13 Un modelo para el PTGS, señales sistémicas In this issue: Small RNA on the Move. The Plant Cell, Vol. 16, 1951–1954, August 2004. A Systemic Small RNA Signaling System in Plants. Byung-Chun Yoo y col. The Plant Cell, Vol. 16, 1979–2000, August 2004

14 Genética reversa IV. Construcciones antisentido. Aplicaciones del modelo de PTGS Construct design for efficient, effective and high throughput gene silencing in plants (2001) S. V. Wesley y col. The Plant Journal 27, 581-590 Application of gene silencing in plants (2001) M-B Wang and P M Waterhouse Current Opinion in Plant Biology 5:146– 150

15 Genética reversa IV. Construcciones antisentido. Un ejemplo A Genetic Screen for Candidate Tumor Suppressors Identifies REST. Westbrook, T.F. y col. 2005. Cell, Vol. 121, 837–848. Las células para el screening (TLM-HMECs), están predispuestaas a la transformación tumoral, se crearon introduciendo la subunidad catalítica de la telomerasa humana (hTERT) y el antígeno grande de SV40 en una línea derivada de células epiteliales de mama humana. Además, estas células tienen niveles elevados del gen c-myc, debido a sus múltiples pases por cultivo in vitro. Las células no proliferan, sin embargo en la ausencia de matriz extracelular, lo cual es fundamental para el éxito del screening.

16 Genética reversa IV. Construcciones antisentido. Un ejemplo La expresión de myr-p110α, un mutante activado del promotor de tumores PI(3)K (phosphatidylinositol 3'-kinase), produce crecimiento independiente del medio de anclaje. El efecto no es un artefacto de la sobreexpresión, se consigue también mediante supresión, mediada por shRNA, de la expresión de PTEN, un antagonista de PI(3)K

17 Genética reversa IV. Construcciones antisentido. Un ejemplo Para el screening, se infectaron células TLM-HMEC con una librería retroviral de 28000 short- hairpin RNAs (shRNA). Diseñados para alterar la expresión de unos 9000 genes. Cada shRNA estaba ligado a una secuencia única de 60 bp para la posterior identificación de la construcción Las células capaces de desarrollar colonias en ausencia de matriz de anclaje fueron analizadas por dos vías. AB AB

18 Genética reversa IV. Construcciones antisentido. Un ejemplo La secuenciación de 200 colonias identificó 25 genes, 18 de ellos encontrados también mediante la estrategia de pooling e hibridación.

19 Genética reversa IV. Construcciones antisentido. Un ejemplo El 90 % de los shRNA iban dirigidos contra 8 de los 25 genes en la lista (ver tres de ellos en la figura), el diseño de nuevos shRNAs ha permitido validar algunos de estos genes. La estrategia utilizada ha servido para identificar nuevos genes con actividad supresora de tumores

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