MICROSCOPIA OPTIMIZADA POR ORDENADOR

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IPBLN MICROSCOPIA OPTIMIZADA POR ORDENADOR CONSEJOS DE CAPTURA DE IMÁGENES DESDE EL MICROSCOPIO IPBLN Jose Luis Luque Ojeda Jose Luis Luque Ojeda

IPBLN MICROSCOPIA OPTIMIZADA POR ORDENADOR INTRODUCCIÓN CONSIDERACIONES PREVIAS POSIBLES CAUSAS DE UNA MALA IMAGEN AJUSTE KOHLER MALOS PROCEDIMIENTOS CAPTURA DE IMAGEN CONSEJOS IPBLN Jose Luis Luque Ojeda Jose Luis Luque Ojeda

IPBLN MICROSCOPIA OPTIMIZADA POR ORDENADOR INTRODUCCIÓN Para obtener unos buenos resultados en el análisis de imagen, es importantísimo partir de una buena adquisición de esa imagen. IPBLN Jose Luis Luque Ojeda Jose Luis Luque Ojeda

IPBLN MICROSCOPIA OPTIMIZADA POR ORDENADOR CONSIDERACIONES PREVIAS HACER BIEN LOS PROTOCOLOS DE FIJACIÓN, TINCIÓN …. CANTIDAD DE CÉLULAS O TEJIDO SUFICIENTE PARA QUE NO FALLE NUESTRA OBSERVACIÓN SI VAMOS A CONTAR CELULAS EVITAR AGREGADOS PERO POCAS CELULAS SON POCO REPRESENTATIVAS MONTAJE: CON MEDIO DE MONTAJE DURARÁ MÁS TIEMPO ETIQUETADO: SABER QUE ES LO QUE SE HA PUESTO EN EL PORTAOBJETOS MUESTRAS DUPLICADAS: SI SE PUEDE SABER EXACTAMENTE LO QUE BUSCAMOS IPBLN Jose Luis Luque Ojeda Jose Luis Luque Ojeda

IPBLN MICROSCOPIA OPTIMIZADA POR ORDENADOR CONSIDERACIONES PREVIAS USAR CONTROLES CASOS DE EMISIONES DE FLUORESCENCIAS PRÓXIMAS EN EL ESPECTRO COLOCALIZACIÓN USAR UN BUEN CUBRE PARA CONFOCAL 0,17 mm VER LA CALIDAD # 1,5 NO LLENAR EL PORTA DE MUESTRAS EN EL BORDE PUEDE CHOCAR LA PLATINA CON EL OBJETIVO NO APOYAR BIEN EL PORTA, SE PUEDE LEVANTAR, INCLINARSE… NO PODER ENFOCAR BIEN VERIFICAR QUE TIENE ACEITE EL OBJETIVO, SI LO NECESITA IPBLN Jose Luis Luque Ojeda Jose Luis Luque Ojeda

IPBLN MICROSCOPIA OPTIMIZADA POR ORDENADOR CONSIDERACIONES PREVIAS SI SE VA A OBSERVAR CÉLULA VIVA PREPARACIÓN ANTICIPADA DE LA Tª Y CO2 PREPARAR EL SISTEMA: AL MENOS 1 HORA PARA LA Tª VERIFICAR EL CO2 EN LA PLACA: IDEALMENTE USAR MEDIO SIN ROJO FENOL, QUENCHING (DISMINUYE LA SEÑAL, AUMENTA EL FONDO) USAR UN POCILLO CON ROJO FENOL PARA CONTROLAR pH COMPROBAR QUE EL FLUOROCROMO AGUANTA LA LARGA DURACIÓN DEL EXPERIMENTO Si se va a excitar 200 veces en 24 horas, excitarlo 200 veces en 16 min. Mas vale perder 16 min. que 24 horas de observación. ASEGURARSE QUE TODO FUNCIONA BIEN, NO SE TIRAN 24 HORAS. VERIFICAR QUE LA PLACA DEJA PASAR LA FLUORESCENCIA Y EN SU CASO LOS LÁSERES. IPBLN Jose Luis Luque Ojeda Jose Luis Luque Ojeda

IPBLN MICROSCOPIA OPTIMIZADA POR ORDENADOR POSIBLES CAUSAS DE UNA MALA IMAGEN 1. Verificar que la iluminación sea la correcta. 2. Verificar que las lentes del objetivo estén limpias. 3. Comprobar que entre el diafragma de campo y el de abertura, no haya ningún filtro difusor. 4. El centrado del revólver portaobjetivos debe ser el correcto. 5. El portaobjetos y el cubreobjetos deben estar limpios. Comprobar que el primero esté bien colocado, y que no haya dos cubreobjetos superpuestos. 6. Verificar la limpieza de todo el sistema óptico. Esto se puede efectuar haciendo girar por separado los oculares que el microscopio posea, comprobando si las pequeñas motas de suciedad se mueven Si es así, es que hay que limpiar el ocular. Luego, habrá que hacer girar el tubo ocular en su conjunto; éste no debe ser desmontado nunca, pero sí se pueden limpiar cuidadosamente los prismas soplando sobre las superficies accesibles. El objetivo puede limpiarse desenroscándolo ligeramente y ayudándose de un pincel seco. En la cámara de fotos: Si al girarla, las manchas no se mueven, las partículas están en la cámara. ¡¡CUIDADO PUEDE SER PEOR EL REMEDIO QUE LA ENFERMEDAD!! IPBLN Jose Luis Luque Ojeda Jose Luis Luque Ojeda

IPBLN MICROSCOPIA OPTIMIZADA POR ORDENADOR POSIBLES CAUSAS DE UNA MALA IMAGEN 7. Comprobar que el aceite de inmersión sea el suficiente, sin burbujas ni impurezas, y que no sea fluorescente. Que no haya miserias ni derroches. Excesos ensucian y manchan objetivos, mesa, dedos, manos… 8. Asegurarse de que el objetivo está bien enroscado. 9. Verificar el grosor del cubreobjetos, portaobjetos y medio de montaje, que es decisivo, sobre todo en medianos y grandes aumentos. Es importante, igualmente, NO COLOCAR DOS CUBREOBJETOS SUPERPUESTOS. 10. La montura del condensador debe estar bien centrada y la frontal bien sujeta, en el caso de que sea abatible. Comprobar que la cremallera esté bien apretada, para mantener la posición. 11. La intensidad lumínica no debe ser débil, ni excesiva. No hay que regularla nunca con el diafragma del condensador. 12. Tener cuidado de no utilizar objetivos de contraste de fases para observaciones de campo claro, sobre todo cuando trabajamos con grandes aumentos. IPBLN Jose Luis Luque Ojeda Jose Luis Luque Ojeda

IPBLN MICROSCOPIA OPTIMIZADA POR ORDENADOR POSIBLES CAUSAS DE UNA MALA IMAGEN 13. Utilizar una combinación correcta entre el ocular y el objetivo, pues puede ocurrir que el ocular sea demasiado potente. 14. Comprobar que la preparación esté bien hecha, comparándola con una preparación test. 15. En contraste de fases, es común el error en el centrado del anillo de iluminación. Aunque éste puede descentrarse debido a la geometría de las estructuras. 16. En observaciones con fluorescencia, las fluorescencias parásitas que se pueden descubrir pueden ser debidas a: el medio de montaje, al aceite de inmersión, una óptica inadecuada, el uso de un filtro incapaz de cortar los rayos de excitación. 17. Si el medio de montaje tiene un índice de refracción muy similar al del objeto incoloro, éste no podrá verse, ni con contraste de fases, ni con contraste interferencial. 18. Si se observa una neblina solamente en los bordes del campo, se deberá a una mala corrección de esfericidad del campo por parte del sistema óptico. Con objetivos caros es raro que ocurra. IPBLN Jose Luis Luque Ojeda Jose Luis Luque Ojeda

IPBLN MICROSCOPIA OPTIMIZADA POR ORDENADOR POSIBLES CAUSAS DE UNA MALA IMAGEN 19. En DIC, comprobar que efectivamente está el prisma de corredera bien colocado. Con placas Petri de plástico, no se podrá manifestar el rendimiento óptico normal debido a la característica de polarización de la Placa Petri, con lo que se recomienda usar una de vidrio. 20. Si se va a hacer colocalización no deben de estar interpuestos ningún prisma en la trayectoria de la luz fluorescente, ya que los primas producen la difracción la luz. IPBLN Jose Luis Luque Ojeda Jose Luis Luque Ojeda

IPBLN MICROSCOPIA OPTIMIZADA POR ORDENADOR AJUSTE KÓHLER NECESARIO PARA UN BUEN ALINEAMIENTO DE LA LUZ AJUSTES PARA LUZ TRANSMITIDA-CAMPO CLARO SEGÚN KÓHLER Para la representación más fiel posible de un objeto juegan un papel muy importante, además de los llamados haces de luz directos, también los indirectos, es decir, los haces de luz difractados y dispersados en los detalles del preparado. Según ABBE vale: Cuanto mayor es el factor de los haces de rayos indirectos (apertura), tanto más fiel al objeto será la representación microscópica. Para aprovechar el rendimiento óptico total del microscopio, en particular del objetivo, el condensador, el diafragma de campo luminoso y el diafragma de apertura deberían estar ajustados según el principio de iluminación de KÓHLER, PROCEDIMIENTO El microscopio debe estar conectado, con la lámpara halógena encendida. Regular la claridad de la imagen mediante el regulador de luz. Poner un preparado con contrastes fuertes en la platina de desplazamientos en cruz. Intercalar en caso dado la óptica frontal del condensador, se recomienda el objetivo de menor aumento y llevar el condensador mediante el mando para movimiento vertical hasta el tope superior. El tope tiene que estar ajustado de tal manera que el preparado no sea levantado por el condensador. Intercalar el objetivo 10x mediante el revólver portaobjetivos y enfocar el preparado mediante el mando de enfoque. IPBLN Jose Luis Luque Ojeda Jose Luis Luque Ojeda

IPBLN MICROSCOPIA OPTIMIZADA POR ORDENADOR AJUSTE KOHLER Cerrar el diafragma de campo luminoso, hasta que se pueda ver (aunque poco nítido) en el campo visual , Bajar el condensador mediante el mando para movimiento vertical hasta que el borde del diafragma de campo luminoso aparezca con suficiente nitidez. Centrar la imagen del diafragma de campo luminoso mediante los dos tornillos de centrado situados en el portacondensador Abrir después el diafragma de campo luminoso hasta que su borde justamente desaparezca del campo visual . Para ajustar el diafragma de apertura (contraste) sacar un ocular del portaoculares y mirar a simple vista por el tubo- Ajustar el diafragma de apertura a unos .2/3 .,.4/5 del diámetro de las pupilas de salida de los objetivos. En la mayoría de las aplicaciones, este ajuste del diafragma. de apertura proporciona el mejor contraste con una resolución casi completa, y por lo tanto representa el compromiso más favorable para la vista humana. Volver a insertar el ocular en el portaoculares IPBLN Jose Luis Luque Ojeda Jose Luis Luque Ojeda

IPBLN MICROSCOPIA OPTIMIZADA POR ORDENADOR MALOS PROCEDIMIETOS BREVEMENTE: EVITARLOS, NO HACERLOS Y SOBRE TODO NO REPETIRLOS Y AVERIGUAR PORQUE SALIÓ MAL IPBLN Jose Luis Luque Ojeda Jose Luis Luque Ojeda

IPBLN MICROSCOPIA OPTIMIZADA POR ORDENADOR BUENOS PROCEDIMIETOS UTILIZAR CONTROLES PROCEDIMIENTO USAR EL QUE TIENE SEÑAL Y AJUSTAR PONER EL CONTROL: SI DA SEÑAL BAJARLO HASTA QUE DESAPAREZCA SI NO DA SEÑAL DEJARLO YA ESTÁ HECHO SI DIO SEÑAL EL CONTROL DESPUÉS DE AJUSTAR HASTA QUE DESAPAREZCA VOLVER A PONER LA MUESTRA PROBLEMA Y AJUSTAR SI NO SE HACE : PENSAR SI LO QUE HACEMOS, LO ESTAMOS HACIENDO BIEN ¿ES UN BUEN PROCEDIMIENTO? VALORACIÓN O TITULACIÓN DE LAS CONCENTRACIONES DE LOS FLUOROCROMOS FACILITA UN AJUSTE ADECUADO DE NUESTRO CONTROL IPBLN Jose Luis Luque Ojeda Jose Luis Luque Ojeda

IPBLN MICROSCOPIA OPTIMIZADA POR ORDENADOR CAPTURA DE IMAGEN USAR EL BOTONCITO DEL SOFTWARE QUE NOS REFERENCIA EL NO SATURAR LAS IMÁGENES. CAPTURA DE IMAGEN UTILIZANDO EL MÁXIMO RANGO DE NIVELES DE GRISES SI SE SATURAN LAS IMÁGENES Y QUEREMOS CUANTIFICAR INTENSIDAD, NO PODRÁN VALORARSE COMPROBAR EN EL RECORRIDO DE Z QUE NO EXISTE SATURACIÓN SI NO SE COMPRUEBA ES COMO “VOY A TENER SUERTE DE GOOGLE” FOTOGRAFÍA OSCURA: SE PODRÁ REALZAR FOTOGRAFÍA SATURADA………… IPBLN Jose Luis Luque Ojeda Jose Luis Luque Ojeda

IPBLN MICROSCOPIA OPTIMIZADA POR ORDENADOR CAPTURA DE IMAGEN DEFINICIONES: BINNING: El proceso de combinar la carga de varios pixeles adyacentes para crear “superpixeles” antes de la lectura. El Binning incrementa la velocidad de refresco y la proporción de señal-ruido de la cámara a cambio de una reducción en la resolución espacial. Es fundamental para enfocar “en vivo” en condiciones de baja luminosidad IPBLN Jose Luis Luque Ojeda Jose Luis Luque Ojeda

IPBLN MICROSCOPIA OPTIMIZADA POR ORDENADOR CAPTURA DE IMAGEN BLOOMING/SATURACIÓN La saturación se relaciona con la intensidad máxima de luz con la que un píxel puede enfrentarse. Si un píxel es pensado como un pocillo de fotoelectrones, la saturación ocurre cuando el pocillo está lleno. El Blooming ocurre cuando el pocillo comienza a desbordar y cobrar (cargar) extensiones en pixeles vecinos, causándolos saturación. El desbordamiento se resalta como una raya blanca o la gota alrededor de un punto brillante sobre la imagen. IPBLN Jose Luis Luque Ojeda Jose Luis Luque Ojeda

IPBLN MICROSCOPIA OPTIMIZADA POR ORDENADOR CONSEJOS NECESARIO UN BUEN ALINEAMIENTO DE LA LUZ SI TENEMOS LUZ PARÁSITA: FOTOGRAFÍA EN BLANCO, SIN MUESTRA, PARA ELIMINAR LOS RUIDOS. UTILIZAR EL SOFTWARE PARA REFERENCIAR LA NO SATURACIÓN DE LAS IMÁGENES A LA HORA DE HACER Z-STACKS: SABER DETERMINAR LA DISTANCIA IDEAL PARA EVITAR DESENGAÑOS PÍXELES ALARGADOS, VESÍCULAS CORTADAS… NO SE OBTIENEN CUANTIFICACIONES ADECUADAS IPBLN Jose Luis Luque Ojeda Jose Luis Luque Ojeda

IPBLN MICROSCOPIA OPTIMIZADA POR ORDENADOR CONSEJOS SI EL FLUOROCROMO SE QUEMA CON FACILIDAD PLANTEARSE SI HACER LA IMAGEN CON MENOR RESOLUCIÓN HACER PRIMERO TODO EL STACKS DEL FLUOROCROMO QUE ANTES SE QUEMA NO PERDER EL TIEMPO BUSCANDO CÉLULAS CON LA FLUORESCENCIA SIN OBTENER IMÁGENES BAJAR LA POTENCIA DEL LASER SI ES NECESARIO Y TENER UN POCO DE RUIDO AUNQUE HAYA QUE TRATARLO LUEGO DESPUÉS PLANTEARSE SI EXISTE OTRO PARECIDO O SUSTITUIBLE USAR PROTECTORES DE FLUORESCENCIA IPBLN Jose Luis Luque Ojeda Jose Luis Luque Ojeda

IPBLN MICROSCOPIA OPTIMIZADA POR ORDENADOR SI TENÉIS ALGUNA DUDA PREGUNTARME MUCHAS GRACIAS IPBLN Jose Luis Luque Ojeda Jose Luis Luque Ojeda

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