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Metabolismo y rendimiento de los cultivos sobre superficies sólidas. Gustavo Viniegra González Universidad Autónoma Metropolitana, Iztapalapa, D.F. MEXICO.

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1 Metabolismo y rendimiento de los cultivos sobre superficies sólidas. Gustavo Viniegra González Universidad Autónoma Metropolitana, Iztapalapa, D.F. MEXICO

2 Esquema metabólico global Consumo total – S T = S O – S Biomasa - S X = X/Y C Respiración - S Q = X/Y Q ATP Biosíntesis - S in = X/Y in ATP Mantenimiento - S in =mX t Productos - S P = X/Y P

3 Balance metabólico Balance: Y X/S = gX/gS; Y X/P = gX/gP; Y p/S = gP/gS Consumo = Biosíntesis + Producción + Mantenimiento (Modelo de J. Pirt) Si S P = 0;

4 Ciclo de vida de un moho Germinación Crecimento vegetativo Crecimiento aéreo Esporulación Diferenciación

5 Modelo macroscópico La tasa específica de crecimiento, r, está definida como r = (1/ A )d A /dt Se supone que, r, se anula cuando A, se aproxima a, Amax. Modelo de von Bertanlanffy r = {1 – ( A / Amax ) n } A << Amax r ; A Amax, r 0

6 Liberación de calor en la FMS de A. niger sobre bagazo de caña, con glucosa. Dos picos de calor: germinación y crecimiento. Crecen con la concentración del substrato. Datos de Oriol et al.

7 Medición de CO 2 y O 2 Componentes: Columnas de FMS. Cromatógrafo de gases. Computador. Beauveria bassiana sobre cutícula de grilo Tesis de D. Rodríguez, UAM (2009)

8 Respiración, metabolismo y crecimiento de A. niger vs. a w Harina de yuca y bagazo de caña, a w, aumenta por la adición de glucosa en el bagazo. Superior Respiración y consumo de substrato en la FMS Inferior aumenta com a w ( ) Germinación ( ) más breve com mayor a w Datos: E. Oriol et al.

9 FMS con suporte inerte A. niger en bagazo de caña, con jarabe de glucosa. El hongo creció con 400 g/L de glucosa!

10 Cultivo de Verticillium lecanii sobre cutícula de grillo J.E. Barranco-Florido et al. / Enzyme and Microbial Technology 30 (2002) 910–915

11 Respiración de Beauveria bassiana Salvado de trigo o cutícula de grilo. Dos fases respiratorias (Ikasari y Mitchell, 2000) a)Crecimiento exponencial b) Autólisis de parte de la biomasa Datos: D. Rodríguez, tesis doctoral en la UAMI, 2009

12 Balance respiratório Respiración - S Q = X/Y Q ATP biosíntesis - S x = X/Y X ATP mantenimiento - S m =mX t Productos - S P =Y P X + X t está ligada à mantenimiento Si los flujos de O 2 y S están equilibrados, m/ << 1, ( S P = 0) Y, const.. S/ X = 1/Y+m/ 1/Y

13 Cociente respiratorio CR = CO 2 / O 2 Ejemplos: C 6 H 12 O 6 + 6O 2 6 CO 2 + 6H 2 O CR = 6/6 = 1 C 6 H 12 O 6 + 2O 2 2C 2 H 4 O 2 + 2CO 2 + 2H 2 O CR = 2/2 1 Es una indicación del tipo de metabolismo.

14 Modelo respiratorio* Se, X < X C (crecimiento exponencial) Se, X X C ; t t C (autólisis parcial) Biomassa X = X(activa) + X(inactiva) C. Lareo et al. / Enzyme and Microbial Technology 38 (2006) 391–399

15 Crecimiento y Respiración de Mucor bacilliformis Poliuretano. Crecimiento exponencial con Glucosa (100 g/L) Esporulación si el substrato se agota. C. Lareo et al. / Enzyme and Microbial Technology 38 (2006) 391–399

16 Cultivo de Gibberella fujikuroii por FMS Amberlita Substrato: Almidón (189 g/L) La giberelina es producida después de que disminuye la respiración. C. Gelmi et al. : Process Biochemistry 35 (2000) 1227–1233

17 C 6 H 12 O 6 2NAD 6NAD 6NADH 2 2CH 3 CH 2 COOH 2NADH 2 6O 2 6CO 2 6H 2 O 2 6H 2 O 2 6H 2 O +3O 2 catalases e peroxidases

18 Las especies reactivas de oxígeno (ROS) La diferenciación … es una respuesta al estrés oxidativo*. *Hansberg and Aguirre, 1990; Aguirre et al., 2005.

19 Las hifas vegetativas aireadas se pegan para formar hifas aéreas. Secreción de polisacáridos (PS) logX PS A/V = 5 PS A/V = 1

20 El O 2 induce la formación de las hifas aéreas Cuando se aumentan o decrecen las concentraciones de oxígeno,... Se observan, respectivamente, cantidades aumentadas o disminuídas de hifas aéreas... +H Air húmedo, -H Air seco, airO 2 50% O 2, airN 2 50% N 2 (Brit. Mycol. Soc. Symp. Series 27: , 2008)Brit. Mycol. Soc. Symp. Series27

21 La catalasa 3 de N. crassa regula los ROS ligados a la diferenciación. La mutante negativa, cat-3 RIP, produce más hifas aéreas que Wt y más fotones asociados a la producción de ROS. (Brit. Mycol. Soc. Symp. Series 27: )Brit. Mycol. Soc. Symp. Series27

22 La red regulatoria de la respuesta a los ROS en levaduras es muy compleja. Mcs1, Mcs2 e Mcs4 responden a H 2 O 2. MAPK fosforila proteínas regulatorias. Cadena de respuestas génicas. Tomado de: Aguirre et al., Trends in Microbiology. 13(3): 111,2005.

23 Modelo del impedimento estérico* Densidade máxima, max 50 mg (sólidos)/cm 3. Contenido de sólidos 150 mg /cm 3. 2/3 de porosidad (aire) Para el intercambio de O 2 y CO 2. *Laukevics et al. B & B, 27: 1687 (1985). Dados de Nopharatana et al. B & B, 84: 71 (2003); Fotografía: D. Rodríquez, 2008

24 Relación entre densidades de superficie, A, y de volumen, V. V = g/cm 3 ; A = g/cm 2, h = cm; V = A /h densidad de volumen = densidad de superficie/espesor S0S0 S0S0 O2O2 h c 0.01 cm V 0.05 g/cm 3 A = V h 0.01 g/cm 2 h 0.2 cm h c h

25 Agotamiento del O 2 por R. oligosporus crecido en caja Petri h C = 60 m; espesor de la capa crítica para el O 2

26 ¿Como se calculará el espesor crítico (h C ) de un micelio? z = h C C = C 0 (1-z/h C ) 2 z

27 Comentario sobre h C El valor de, h C = 0.01 cm = espesor de la capa aeróbica. Fué medido con electrodos sensibles a oxígeno. El valor h h C, es el espesor de las capas aeróbica y anaeróbica

28 Integración de los modelos El micelio crece exponencialmente con un balance redox (Difusión = Consumo). Al llegar a un nivel V < g/cm 3, la difusión de O 2 es más lenta que su demanda. La penetración del oxígeno es, h C < 0.01 cm. El micelio con h > h C, es anóxico y no produce más biomasa, pero consume y transporta sustrato.

29 Crecimiento en capa fina La capa aerobia con espesor, h C, crece hasta que V = Vmax O 2 O 2 La capa anaerobia consume substrato sin crecer. Y x/s decrece si, h C S S S Capa aerobia Capa anaerobia Agar con substrato hChC

30 Definición de 0 (g/cm 2 ) S 0 = concentración del sustrato dentro del soporte (g/cm 3 ). A = área del soporte (cm 2 ) V = volumen del suporte (cm 3 ) 0 = S 0 V/A (g/cm 2 ) 0 = Sustrato inicialmente disponible en toda la superficie de contacto con el micelio. = A/V (área específica); 0 = S 0 /

31 Cálculos de Placa con espesor, H; 1/H Ejemplo: placa de agar H = 1 cm; 1/cm Cilindro con diámetro, d; 4/d Ejemplo: fibra con d = 0.1 cm; 40/cm Esfera con diámetro, d; 6/d Ejemplo: esferas con d = 0.02 cm; 300/cm

32 Volúmenes específicos (A/V) Matraz de 250 mL con V = 50 mL de agua A/V = 2/cm Menisco de 0.06 cm de espesor A/V = 333/cm

33 A. niger en PUF con glucosa ¿Por qué la pendente es fija para FMS ( )? Y X/S = 0.35 gX/gS ¿Por qué es variable para FSm ( )? 0 < S 0 < 100g/L Datos de SJ Romero, 2001

34 Crecimiento de A. niger en caja Petri. A h V = A /h V no varía con 0 1/Y = 1/Y / Y 0 = 0.5; si 0 << capa aeróbica) V h max Amax A Datos de E. Ortega, 2012

35 Crecimiento en capa fina La capa aerobia con espesor, h C, crece hasta que V = Vmax O 2 O 2 La capa anaerobia consume substrato sin crecer. Y x/s decrece si, h C S S S Capa aerobia Capa anaerobia Agar con substrato hChC

36 Modelo de Nopharatana et al. (1998, 2003)* El micelio aerobio crece h < h C hasta que V Vmax La capa aerobia sigue creciendo y formando nuevo micelio. La capa anaerobia transporta sustrato (translocación) El modelo no explica los resultados experimentales con Rhyzopus oligosporus (vea el Problema 3). *Biotechnol. Techniques,12(4): 313–318, 1998; B & B 84(1): 71-77, 2003

37 ¿Qué controla las densidades de los hongos? Diferentes con distintas cepas de A. niger. Diferentes con la misma cepa de A. niger y diferente soporte. (mg/cm 2 ) vs. vs.

38 Efecto de cepa y soporte sobre Las mutantes con menor eficiencia, tendrán menor. Los soportes con menos espacio intersticial tendrán menor. mide la máxima producción de biomasa sobre la superficie. Cuando 0 < 1 mg/cm 2 el rendimiento es máximo y similar para diferentes cultivos.

39 Consecuencias del modelo Dos fases respiratórias exponenciales: creciente y decreciente. La 1ª metabolitos primários; la 2ª metabolitos secundários, esporulación. Transición: acumulación de espécies reactivas de oxígeno (ROS). La variación de 0 controla el espesor y tipo de metabolismo de la capa fúngica.

40 Aplicaciones: Control respiratorio en línea control de la FMS. El O 2 limita la densidad y espesor de la biomasa sobre superfícies sólidas. Pulsos de O 2 esporulación.

41 Los pulsos de O 2 aumentan la esporulación en superficie Tratamiento X=biomasa (mg cm -2 ) Conidia (x10 7 coni dia cm -2 ) Y C/X (x10 7 conidia mg -1 X) P (x10 5 conidia cm -2 h -1 ) 21% O * (±0.25) 2.08 (±0.21) 0.43 (±0.05) 1.33 (±0.13) 26% O (±0.18) 4.25* (±0.13) 1.12* (±0.03) 2.72* (±0.08) Metarhizium anisopliae var. lepidiotum Tecuitl-Beristain et al. Mycopathologia (2010) 169:387–394

42 Problema 1 ¿Cuántas bandejas por lote quincenal se requieren para producir esporas de M. anisopliae, aplicadas en 5,000 Ha?¿Cuántas Ha cubrirá esa fábrica en 300 días? Datos: 1.36 kg (MS) de salvado de trigo por bandeja con partículas cúbicas de 0.05 cm de arista y 60% de humedad. C = 3x10 7 esporas por cm 2. Cada Ha requiere esporas

43 Problema 2 Columnas con gránulos esféricos de almidón (d = 0.05, 0.1, 0.2, 0.4 cm) y sales minerales. El almidón retiene una vez su volumen de agua y se degrada en un 80%. Un cultivo de A. niger, produce rendimientos Y = 0.69, 0.32, 0.24, 0.16 (gX/gS). Calcule, el área total de 1 kg (húmedo) de gránulos con d = 0.15 cm y densidad del sustrato 1.2g/cm 3 Calcule y estime la biomasa producida con ese d.

44 Problema 3 Compare los artículos de Oostra et al. (2001) y Rahardjo et al. (2002) sobre h C. Diga por qué los perfiles de oxígeno en el micelio explican las diferencias entre el modelo de Nopharatana et al. (1998) y sus resultados de ¿Cómo se imagina la capa de Rhyzopus oligosporus?

45 Problema 4 Explique por qué los cultivos aireados de A. niger sobre partículas de agriolita, pueden metabolizar jarabes hipertónicos de glucosa (300 g/L). Suponga que las partículas tienen A/V = 50/cm y que Y 0 = 0.5, = g/cm 2. Calcule Y. Discuta qué tipo de metabolismo estará ocurriendo. ¿Cómo será el cociente respiratorio? Revise el Balance Metabólico


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